利用胚胎干细胞特异性高表达MicroRNAs调控猪克隆胚胎基因组重编程的实验研究

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AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    31271330
  • 项目类别：
    面上项目
  • 资助金额：
    80.0万
  • 负责人：
    王勇
  • 依托单位：
    中国人民解放军第三军医大学
  • 学科分类：
    C0604.表型、行为与疾病的遗传学基础
  • 结题年份：
    2016
  • 批准年份：
    2012
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2013-01-01 至2016-12-31

项目摘要

Pig is an important organism both for bio-medical research and agricultural production. Currently, the clone technology based on somatic cell nuclear transfer (SCNT) is the main method for pig genetic manipulation. However, the low efficiency of this technology limits the development of novel genetically modified pigs for bio-medical or agricultural purposes. It is well established that somatic genomic reprogramming is the limitting factor determining the developmental potential of cloned embryos and the resulted clone efficiency. Very recently, it was reported that the microRNAs preferrently expressed in embryonic stem cells (ESC-specific microRNAs) were capable of rebustly and efficiently inducing pluripotent cells (iPSC) without trasncriptional factors, and the efficiency of somatic genomic reprogramming mediated by ESC-specific miRNAs was up to 10%, which was almost two order magnititude of that of the conventional method using transcription factors. In this project, we are planning to systematically evaluate the impacts of ESC-specific miRNAs, which contain different seed sequences and target different genes, on genomic repragramming and developmental potential of pig cloned embryos and the resulted overall clone efficieny, and then thereby to select the microRNAs or microRNA combinations with the highest efficiency. The completion of the work described in this project would laid down a foundation to establish a highly effieicent technological system for pig SCNT.
猪是重要的医学模型与经济动物。体细胞克隆是研制人类重大疾病转基因猪模型、培育重要经济性状转基因猪新品种的主要途径。现有猪体细胞克隆技术的低效率（一般低于1%）是制约转基因猪疾病模型与新品种培育规模化开展的主要因素，而如何促进克隆胚胎基因组在短时间内完成重编程是提高猪克隆效率的关键。最近研究表明，在胚胎干细胞中特异性高表达的microRNAs具备很强的快速介导体细胞基因组重编程的能力，其单独诱导形成iPS细胞的效率比传统4个转录因子（OSKM）高100倍以上，且诱导时间缩短1倍。本项目拟将含有不同"种子序列"（seed sequence）、针对不同靶基因的胚胎干细胞特异性microRNAs导入猪克隆胚胎，系统评估不同microRNA对猪克隆胚胎基因组重编程、发育能力以及猪克隆效率的影响，筛选适宜于猪克隆胚胎胞质微环境、效应最优的microRNA或其组合，为建立更高效的猪克隆技术体系奠定基础。

结项摘要

本项目的关键科学问题是评估胚胎干细胞特异性的microRNAs（miRNAs）对猪克隆胚胎基因组重编程的影响、筛选可促进猪克隆胚胎基因组重编程的胚胎干细胞特异性miRNAs，进而促进猪克隆胚胎基因组重编程、提供克隆猪培育效率;本项目的关键技术问题是建立高效的猪基因敲入技术，制备干细胞特异性基因位点敲入标记基因的转基因猪及其衍生细胞系，为准确评估胚胎干细胞特异性miRNAs对猪克隆基因组重编程的影响提供高活性的工具细胞和正常胚胎对照。.依据本项目同行评议建议及项目的原定计划，我们首先建立了高效的猪基因敲入技术体系。首次发现猪胚胎细胞具有很强的通过HDR（homology-directed repair）机制修复DSB的活性、进而实现高效率基因敲入的能力；基于此发现，我们研制了首例含有人同源点突变的基因编辑猪疾病新模型和首例血清白蛋白人源化转基因猪，首次通过CRISPR/Cas9诱导的HDR实现了外源基因在首建猪中100%的定点敲入率，并首次发现作为HDR模板的ssODN（single strand oligo DNA）高浓度时可抑制猪胚胎细胞中的HDR活性；此外，还研制了在alpha S1-Casein（alpha S1酪蛋白）基因位点敲入乳铁转运蛋白（LTF）的转基因猪和乳铁转运蛋白-溶菌酶（LTF-LYZ）的复合转基因猪，为解决仔猪哺乳期抗病性这一养猪业重要问题奠定了基础。.依托建立的高效基因敲入技术体系，开展了在Oct4基因位点终止密码子位点敲入标记基因EGFP的（Oct4-EGFP）转基因猪制备实验，目前已有一个受体成功受孕，有望获得OCT4与EGFP可视化共表达的转基因猪，进而为更准确的评估胚胎干细胞特异性miRNAs对猪克隆胚胎基因组重编程的影响提供高活性工具细胞和正常胚胎对照；利用中国科学院广州生物医药与健康研究所赖良学课题组惠赠的在Oct4基因终止密码子位点敲入了RFP（Oct4-RFP）的细胞为工具细胞，初步评估了胚胎干细胞特异性miRNAs对克隆胚胎基因组重编程的影响，发现胚胎干细胞特异性miRNAs的导入对克隆胚胎早期发育无显著影响，但可促进RFP的表达，提示胚胎干细胞特异性miRNAs可促进猪克隆胚胎的基因组重编程。

项目成果

期刊论文数量（3）
专著数量（1）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
Production of Human Albumin in Pigs Through CRISPR/Cas9-Mediated Knockin of Human cDNA into Swine Albumin Locus in the Zygotes.
通过 CRISPR/Cas9 介导的人 cDNA 敲入受精卵中的猪白蛋白基因座在猪中生产人白蛋白
  • DOI：
    10.1038/srep16705
  • 发表时间：
    2015-11-12
  • 期刊：
    Scientific reports
  • 影响因子：
    4.6
  • 作者：
    Peng J;Wang Y;Jiang J;Zhou X;Song L;Wang L;Ding C;Qin J;Liu L;Wang W;Liu J;Huang X;Wei H;Zhang P
  • 通讯作者：
    Zhang P
Efficient Generation of Gene-Modified Pigs Harboring Precise Orthologous Human Mutation via CRISPR/Cas9-Induced Homology-Directed Repair in Zygotes
通过 CRISPR/Cas9 诱导受精卵同源定向修复，高效生成携带精确直系同源人类突变的基因修饰猪
  • DOI：
    10.1002/humu.22913
  • 发表时间：
    2016-01-01
  • 期刊：
    HUMAN MUTATION
  • 影响因子：
    3.9
  • 作者：
    Zhou, Xiaoyang;Wang, Lulu;Wei, Hong
  • 通讯作者：
    Wei, Hong

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  • 通讯作者：
    王勇

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AI项目解读示例

课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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