胞外基质蛋白Fibulin-4对三种基因型草鱼呼肠孤病毒组织嗜性的影响及其作用机制研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
31672690
项目类别：
面上项目
资助金额：
62.0万
负责人：
吕利群
依托单位：
上海海洋大学
学科分类：
C1908.水产生物病原学与病害控制
结题年份：
2020
批准年份：
2016
项目状态：
已结题
起止时间：
2017-01-01 至2020-12-31

项目参与者：
许丹；张也；王浩；宗乾坤；喻飞；孙朋辉；张国亮；刘玮莎；盛佳璐；
关键词：
基因型侵染宿主病毒病致病机理

项目摘要

Grass carp reovirus is the causing pathogen for grass carp hemorrhagic disease. In the pilot study of this project, the outermost capsid protein VP7 of GCRV-873, VP56 of GCRV-HZ08, and VP55 of GCRV-104 interacted with grass carp extracellular protein Fibulin-4 in yeast-two hybrid screen. Here，different methods will be applied to study the in vitro and in vivo interactions between Fibulin-4 and each of the viral outer capsid proteins, which include gene mutagenesis and expression, protein binding in vitro, immunohistochemistry and small ligands-mediated binding inhibition tests. The results should contribute for clarifying the role of Fibulin-4 in tissue tropism of all genotypes of grass carp reoviruses, and be helpful in understanding the clinical symptoms of GCRV infection that demonstrate bleeding in muscle, opercular and intestine.Characterization of the interactions between Fibulin-4 and outermost capsid proteins of all the three genotypes of GCRV paves the way for designing broad-spectrum antiviral drug from the structure-activity relationships.

草鱼呼肠孤病毒（Grass carp reovirus,GCRV）是草鱼出血病的致病病原。前期研究发现：GCRV-873类型病毒的最外层衣壳蛋白VP7、GCRV-HZ08类型病毒的纤突蛋白VP56和GCRV-104类型病毒的纤突蛋白VP55 均与草鱼胞外基质蛋白Fibulin-4在酵母内相互作用。本项目拟利用基因突变体构建与表达、体外蛋白质结合实验、免疫组织化学分析、Fibulin-4的阻断剂竞争抑制实验等方法进一步确证Fibulin-4与3种基因型GCRV最外层衣壳蛋白在体、内外的相互作用及其效应。项目的研究结果将明确Fibulin-4 在GCRV组织嗜性中的作用机制, 并有利于阐明临床上红肠、红肌肉和红鳃盖三种典型草鱼出血病症状出现的分子病理学基础; 解析三种基因型GCRV病毒最外层衣壳蛋白与同一种胞外基质蛋白Fibulin-4的相互作用，也能从药物构效关系上指导合成广谱抗病毒药物。

结项摘要

我国草鱼年产量超过500万吨，是产量最大的水产鱼类养殖品种。进入21世纪，草鱼出血病的致病病原呈现以II型草鱼呼肠孤病毒（GCRV）感染为主、偶发I型和II型GCRV混合感染、III型GCRV感染少见的新特征。现有的针对I型GGCRV的减毒疫苗无法防治II型和III型GCRV感染，开发对3种基因型GCRV有效的广谱抗病毒药物也成为我国病毒性草鱼出血病防控的重大需求。本研究通过蛋白质互作、细胞共定位实验探讨了I型GCRV最外层衣壳蛋白VP7、II型GCRV纤突蛋白VP56和III型GGCRV纤突蛋白VP55 分别与胞外基质蛋白Fibulin-4（EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 2 ）的相互作用，阐明了Fibulin-4分子在GCRV组织嗜性中发挥作用的分子基础。本研究利用噬菌体展示技术鉴定了Fibulin-4编码序列中与II型GCRV的VP56蛋白相互作用的多肽序列，利用细胞系及稀有鞠鲫感染模型证明了该多肽具有较好的抗病毒活性。根据已知Fibulin-4与硫酸乙酰肝素分子相互作用的特性，本研究还评估了肝素分子及其结构类似物对三种基因型GCRV的竞争性抑制效应，证实了基于Fibulin-4与GCRV外衣壳蛋白之间的相互作用开发通用抗GCRV小分子药物是可行的。由于在研究过程中，有课题组报道热休克蛋白Hsp70可能是III型GCRV的细胞表面受体，提示III型GCRV病毒外衣壳纤突蛋白可能与Hsp70相互作用；本研究也以I型和III型GGCRV为研究对象，研究了两种病毒对Hsp70的诱导效应和Hsp70的促病毒作用，发现I型GCRV编码的NS31蛋白是一个特异性的Hsp70转录调控蛋白，抑制Hsp70的表达可以抑制I和III型GCRV的感染，因此Hsp70分子提供了另一个广谱抗GCRV感染的潜在靶点。综上，本项目的实施不但解析了三种基因型GCRV组织嗜性的分子基础，也提供了两种潜在的广谱抗GCRV感染的新靶标。