単粒子法を応用した分子モーターキネシン・微小管複合体のクライオ電子顕微鏡構造解析

单粒子法冷冻电子显微镜结构分析分子运动驱动蛋白-微管复合物

基本信息

批准号：
13J05975
负责人：
森川真夏
金额：
$ 1.73万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

モーター分子KIFと微小管の複合体を高解像度で観察することは細胞内輸送の分子メカニズムを解明するため、クライオ電子顕微鏡を利用し、１）KIF19Aの微小管脱重合活性と運動性の分子メカニズム、２）KIF5Cによる微小管への協同的結合の分子機構　の研究を行った。試料は理化学研究所横浜キャンパスのTecnai Arcticaクライオ電子顕微鏡で撮影し、微小管のらせんパラメータをRuby Helixプログラムで決めたあと、Frealignプログラムのヘリカル再構成法により解析した。各試料について数万～数十万粒子のαβチューブリンKIF三量体から最終構造を得た。１）微小管に沿った運動に加えて、微小管の脱重合に関わる分子モーターKIF19Aについて、taxol-GDP微小管との複合体を作成し、クライオ電子顕微鏡法にて7.0 オングストロームの解像度の構造を解いた。この結果、KIF19Aは、微小管先端の曲がったチューブリン構造にも結合が可能なフレキシブルなL8ループと、微小管との結合と運動に関わるL12ループ、さらに脱重合型KIFに特徴的な長いL2ループを介して、微小管と複合体を形成していることが明らかになった。２）Taxolなどの微小管安定化剤を入れていないGDP型微小管は、ATP存在下でKIF5Cが結合すると、KIF5C親和的な性質を持つことが知られている（KIF5の協同的結合）。この現象の構造的な背景を探るため、様々なヌクレオチド状態の微小管とKIF5Cの各複合体構造を5 ~ 7 オングストロームの解像度で解いた。その結果、KIF5Cと微小管のヌクレオチド状態によって、微小管のピッチが伸長することを明らかにした。この結果は、KIF5Cの運動に伴って微小管が構造変化をし、この微小管の構造変化がさらにKIF5Cの運動に影響を与えることを示唆している。

利用冷冻电子显微镜高分辨率观察运动分子KIF与微管之间的复合物，阐明细胞内运输的分子机制。1）KIF19A微管解聚活性和运动的分子机制，2）我们研究了KIF19A的微管解聚活性和运动的分子机制。 KIF5C 与微管的协同结合。使用 RIKEN 横滨校区的 Tecnai Arctica 冷冻电子显微镜对样品进行成像，使用 Ruby Helix 程序确定微管的螺旋参数，然后使用 Frealign 程序的螺旋重建方法进行分析。对于每个样品，最终结构是从数万到数十万个 αβ-微管蛋白 KIF 三聚体颗粒中获得的。 1）关于分子马达KIF19A，除了沿着微管运动之外，还参与微管解聚，我们用紫杉醇-GDP微管创建了复合物，并使用冷冻电子显微镜获得了分辨率为7.0埃的结构。因此，KIF19A 具有可与微管尖端的弯曲微管蛋白结构结合的柔性 L8 环、参与微管结合和运动的 L12 环，以及解聚 KIF 特征的长 L2 环研究表明，它们通过环与微管形成复合物。 2) 已知不含微管稳定剂（如紫杉醇）的 GDP 型微管在 ATP 存在下结合 KIF5C 时具有 KIF5C 亲和力（KIF5 的协同结合）。为了探索这种现象的结构背景，我们以 5 至 7 埃的分辨率解析了各种核苷酸状态下的微管-KIF5C 复合物的结构。结果表明，微管节距的延长取决于 KIF5C 和微管的核苷酸状态。这一结果表明，微管随着 KIF5C 的移动而改变结构，并且微管结构的这种变化进一步影响 KIF5C 的移动。