Regulation of oncogenic RAS-induced endoplasmic reticulum stress response by zinc signaling

通过锌信号调节致癌 RAS 诱导的内质网应激反应

• 批准号: 22K11710
• 负责人: 枝松 裕紀
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K11710/
• 关键词: RAS遺伝子; がん; 小胞体ストレス; IRE1; PERK; ATF4; 亜鉛; 統合的ストレス応答; UPR; 細胞内シグナル伝達; MAPキナーゼ

本年度は、まず、RASシグナルによる小胞体ストレスセンサー分子IRE1の活性化と、それに対する細胞内亜鉛の影響を検討した。活性型変異体Hras（HrasG12V）を誘導発現するラット胎児線維芽細胞株Rat-1細胞由来の細胞（Rat-1RasVal細胞）において、IRE1活性化依存的なXbp1の非定型スプライシングがHrasG12V発現により誘導されることを確認した。また、HrasG12V発現によりIRE1のタンパク質の量が増加することも見出した。これらHrasG12V発現が引き起こすIRE1の変化は、MEK/ERK経路を介していることを阻害剤実験で明らかにした。そこで、IRE1の活性と相関し得るリン酸化の検出をphostag法で試みたところ、HrasG12V発現でIRE1のリン酸化が著しく亢進することがわかった。しかし、当初期待した亜鉛依存的なリン酸化については、phostag法の条件を様々に変えてはみたが現時点では検出されていない。またIRE1タンパク質の量の増加についても、プロテアソーム阻害剤などを用いて検討したが、HrasG12V発現や亜鉛濃度による影響は観察されなかった。そこで方針を変え、HrasG12V誘導発現や亜鉛欠乏による細胞死応答が生じないマウス胎児線維芽細胞株3T3細胞由来の細胞（3T3RasVal細胞）で、同様の解析を試みた。その結果、3T3RasVal細胞では、HrasG12V発現ではIRE1活性化依存的なXbp1の非定型スプライシングが誘導されないことがわかった。以上から、HrasG12VによるMEK/ERK依存的IRE1活性化には、Rat-1にはあるが3T3にはない機構が関与すると考えられた。また、Rat-1RasVal細胞を用いた解析の過程で、培地への亜鉛添加とHrasG12V発現とに依存して変化する新たなシグナル系を見出した。

今年，我们首先研究了RAS信号对内质网应激传感器分子IRE1的激活以及细胞内锌对其的影响。在源自诱导表达活性突变体Hras(HrasG12V)的大鼠胎儿成纤维细胞系Rat-1细胞(Rat-1RasVal细胞)的细胞中，证实了HrasG12V的表达诱导了IRE1激活依赖性的Xbp1非典型剪接。我们还发现 HrasG12V 表达增加了 IRE1 蛋白的量。抑制剂实验表明，HrasG12V 表达引起的 IRE1 变化是由 MEK/ERK 通路介导的。因此，我们尝试使用phostag方法检测与IRE1活性相关的磷酸化，发现HrasG12V表达显着增强IRE1磷酸化。然而，尽管 phostag 方法的条件发生了各种变化，但此时尚未检测到最初预期的锌依赖性磷酸化。我们还研究了使用蛋白酶体抑制剂增加 IRE1 蛋白量，但没有观察到 HrasG12V 表达或锌浓度的影响。因此，我们改变了方法，尝试使用源自小鼠胚胎成纤维细胞系 3T3 细胞（3T3RasVal 细胞）的细胞进行类似的分析，这些细胞不表现出 HrasG12V 诱导的表达或由于缺锌而导致的细胞死亡反应。结果表明，HrasG12V 表达不会诱导 3T3RasVal 细胞中 IRE1 激活依赖性 Xbp1 的非典型剪接。由上可知，HrasG12V引起的MEK/ERK依赖性IRE1激活涉及Rat-1中存在但3T3中不存在的机制。此外，在使用Rat-1RasVal细胞进行分析的过程中，我们发现了一种新的信号系统，该系统会根据培养基中锌的添加和HrasG12V的表达而变化。