Challenge to establish a transformation method for the "petroleum"-producing microalga Botryococcus braunii

建立产“石油”微藻布氏葡萄球菌转化方法的挑战

基本信息

批准号：
22K19199
负责人：
岡田茂
金额：
$ 4.16万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

微細緑藻Botryococcus brauniiは、乾燥重量の数十パーセントにも及ぶ大量の液状炭化水素を生産し、細胞外に分泌するため、バイオ燃料源として有望視されているが、現在のところ、外来遺伝子・タンパク質の導入技術が確立されていないため、本藻種自身における遺伝子機能の同定等ができない状況にある。そこで本研究では本藻種に対する信頼性の高い形質転換技術を確立し、炭化水素生産・分泌に関する基礎および応用研究を飛躍的に前進させることを目的とする。今年度は先ず、遺伝子導入への構造的障壁が少ない藻体を作出することに注力した。先行研究を基に、本藻種を1/4海水程度の塩分濃度で培養することで、炭化水素を容易に抽出できる状態にした。これにより群体の最外殻の多糖類の障壁が取り除かれたものと考えられる。また、本藻種の個々の細胞は、脂肪酸の炭素鎖伸長により生成する長鎖脂肪族アルデヒドが重合したバイオポリマーにより繋ぎ止められている。このバイオポリマーも外来遺伝子の導入を阻害している可能性があることから、脂肪酸生合成を抑制することで、群体構造が脆弱な藻体を作出することを試みた。脂肪酸合成酵素の阻害剤としてセルレニンとC75を用いたところ、両者とも脂肪酸合成をin vivoで阻害した。そこで藻体を殺すことなく、脂肪酸の生合成を抑制するのに適したセルレニンの濃度を求めた。また、形質転換体の選抜マーカーとして、過去の研究例ではzeocin耐性遺伝子およびGFP遺伝子が本藻種に対して試みられてきたが、本藻種は葉緑体が大きくクロロフィルの自家蛍光による影響が大きいことから、GFPとは異なる波長を示す蛍光タンパク質の導入の検討を行った。

绿色微藻布氏葡萄球菌产生大量液态碳氢化合物，占其干重的百分之几十，并将其分泌到细胞外，使其成为一种有前途的生物燃料来源，因为这种藻类的引入技术尚未建立，因此尚未建立。可以鉴定该藻类本身的基因功能。因此，本研究的目的是建立一种高度可靠的藻类转化技术，并极大地推进碳氢化合物生产和分泌的基础和应用研究。今年，我们首先专注于创造基因引入结构障碍较少的藻类。根据之前的研究，这种藻类是在约1/4海水的盐度下培养的，可以轻松提取碳氢化合物。这被认为消除了菌落最外层壳中的多糖屏障。此外，这种藻类的单个细胞通过由脂肪酸碳链延长产生的长链脂肪醛制成的生物聚合物连接在一起。由于这种生物聚合物也可能抑制外源基因的引入，因此我们尝试通过抑制脂肪酸生物合成来创造具有弱菌落结构的藻类。当浅蓝菌素和C75用作脂肪酸合成酶抑制剂时，均抑制体内脂肪酸合成。因此，我们确定了适合抑制脂肪酸生物合成而不杀死藻类的浅蓝素浓度。此外，过去的研究曾尝试使用该藻类的zeocin抗性基因和GFP基因作为转化体的选择标记，但该藻类具有较大的叶绿体并且不受叶绿素自发荧光的影响，因此我们对其进行了研究。引入了与 GFP 不同波长的荧光蛋白。