Super-resolution fluorescence lifetime imaging for analysis of mitochondrial membrane potentials at the cristae level

用于分析嵴水平线粒体膜电位的超分辨率荧光寿命成像

基本信息

批准号：
22K19108
负责人：
多喜正泰
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

ミトコンドリアは，膜形態をダイナミックに変化させながらアポトーシスの制御やカルシウム貯蔵など，多岐にわたる細胞機能を精密にコントロールしている．本課題では，第2世代のミトコンドリア内膜標識剤として，MitoPB Redを開発した．MitoPB Redは赤色領域に蛍光を有することに加え，MitoPB Yellowに比べさらに大きな環境応答性を示すことが特徴である．これにより，より長波長の775 nmによる誘導放出が可能となり，明瞭なクリステ構造を捉えることができた．さらに，MitoPB Redは，脂質組成の違いによって誘起される膜極性環境の違いを感受して，異なる蛍光寿命を与えることを見出した．蛍光寿命顕微鏡 (FLIM) でミトコンドリアを観察すると，単一のミトコンドリアにおける内膜組成の不均一性を捉えることに成功した．ミトコンドリアの形態は，膜組成とも関連する．光照射した細胞，あるいはアポトーシス誘導剤で処理した細胞は，脂質膜の酸化に伴い，ミトコンドリアの膨潤が認められる．この様子をFLIMで観察したところ，酸化前に比べて蛍光寿命が長くなっている様子が認められた．これは，不飽和脂質が酸化されることで，結果的に飽和脂質濃度が高くなり，内膜の極性が低下したことに起因する．また，内膜酸化の様子をタイムラプス観察したところ，酸化はすべてのミトコンドリアで同時におこるのではなく，ミトコンドリアの一部が酸化されると，膜特性変化がそのミトコンドリア全体に広がっていく様子が認められた．本現象についてはさらなる検証が必要であるが，MitoPB Redは内膜特性を可視化できる優れたツールであることが示された．

线粒体精确控制多种细胞功能，例如细胞凋亡控制和钙储存，同时动态改变其膜形态。在这个项目中，我们开发了 MitoPB Red 作为第二代线粒体内膜标记剂。除了在红色区域具有荧光外，MitoPB Red 的特点是比 MitoPB Yellow 具有更强的环境响应能力。这使得受激发射能够在 775 nm 的较长波长下进行，使我们能够捕获清晰的嵴结构。此外，我们发现 MitoPB Red 可以感知由脂质成分差异引起的膜极性环境差异，并给出不同的荧光寿命。通过使用荧光寿命显微镜（FLIM）观察线粒体，我们成功地捕获了单个线粒体内膜组成的异质性。线粒体形态也与膜组成有关。在暴露于光或用凋亡诱导剂处理的细胞中，由于脂质膜的氧化而观察到线粒体肿胀。当使用FLIM观察这种情况时，观察到荧光寿命比氧化前更长。这是由于不饱和脂质的氧化，导致饱和脂质浓度升高，内膜极性降低。此外，对内膜氧化的延时观察表明，氧化并不是同时发生在所有线粒体中，而是当线粒体的一部分被氧化时，膜特性的变化会扩散到整个线粒体Ta。尽管需要进一步验证这种现象，但 MitoPB Red 已被证明是可视化内膜特性的出色工具。