酵母転写系を利用したSLG及びSRK結合因子の探索

使用酵母转录系统搜索 SLG 和 SRK 结合因子

基本信息

批准号：
08760005
负责人：
渡辺正夫
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アブラナ科植物の自家不和合性認識機構を解明を目的として、雌しべ側の認識物質であるSLG (S-locus glycoprotein), SRK (S-receptor kinase)と相互作用する花粉、柱頭側の遺伝子を、酵母を使ったTwo-hybrid systemで、単離することを計画した。まず、レセプター型のprotein kinaseをコードしているSRKのkinase domainをプラスミドベクターpVP16, pBTM116に読み枠があうようにクローニングした。また、分泌型のSLGのシグナルペプチドを除いた部分を、同様にクローニングした。それぞれの遺伝子の2種類のプラスミドを、酵母(L40)に形質転換し、-Leu/Trpの培地にまいた。両方のプラスミドを有している酵母について、その相互作用を調べるために、-Leu/Trp/-Hisの培地に継代し、バックグラウンドとして発現しているHisの発現を阻害する2-ATを加えた。SLG9をそれぞれのベクターにクローニングしたものを形質転換した酵母では、-Leu/Trp/-Hisの培地の生育は観察されなかった。一方、SRK-kinase domainをクローニングしたプラスミド相互では、わずかながら、酵母の生育が見られ、相互作用があるものと判断できた。SLGを組み込んだ酵母においてタンパク質の発現を電気泳動によって調べたところ、発現は確認されなかった。このことから、SLG相互作用が検出できなかった一因であると考えられた。pBTM116-SLGをbait(えさ)として、花粉で発現している相互作用する遺伝子の探索を目的として、1核期葯cDNAライブラリーを作製した。同様に、pBTM116-SRK-KDをbaitとして、柱頭中での相互作用する遺伝子探索のために、cDNAライブラリーを作製した。現在、作製した柱頭cDNAライブラリーをpVP16にライゲーションし、相互作用のある遺伝子を探索中である。

为了阐明十字花科植物的自交不亲和识别机制，我们研究了花粉和柱头侧的基因与雌蕊侧的识别物质SLG（S-位点糖蛋白）和SRK（S-受体激酶）相互作用。计划使用酵母的双杂交系统来分离它。首先，将编码受体型蛋白激酶的SRK激酶结构域克隆到质粒载体pVP16和pBTM116的阅读框内。另外，类似地克隆了除信号肽之外的分泌性SLG的一部分。将每个基因的两种类型的质粒转化到酵母(L40)中并铺展在-Leu/Trp培养基上。为了检查携带两种质粒的酵母的相互作用，我们将它们在-Leu/Trp/-His培养基中进行传代培养，并添加2-AT作为背景，其抑制His的表达。在用克隆到每个载体中的SLG9转化的酵母中，在-Leu/Trp/-His培养基中没有观察到生长。另一方面，在克隆了SRK激酶结构域的质粒之间观察到少量酵母生长，表明存在相互作用。当通过电泳检查含有SLG的酵母中的蛋白质表达时，没有确认到表达。这被认为是无法检测到SLG交互的原因之一。以pBTM116-SLG为诱饵，我们构建了单核阶段花药cDNA文库，旨在寻找花粉中表达的相互作用基因。同样，使用 pBTM116-SRK-KD 作为诱饵，创建 cDNA 文库来寻找柱头中的相互作用基因。我们目前正在将创建的柱头 cDNA 文库连接到 pVP16 中并寻找相互作用的基因。