内耳有毛細胞・支持細胞の免疫応答メカニズム-急性感音難聴の遺伝子医療にむけて-

内耳毛细胞和支持细胞的免疫反应机制 - 走向急性感音神经性听力损失的基因医学 -

基本信息

批准号：
22K09744
负责人：
前田幸英
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

当研究では、感覚上皮（有毛細胞・支持細胞）などの蝸牛組織において、Fkbp5やAtf3をはじめとする、自然免疫応答に関係する遺伝子発現がどの様にコントロールされているか明らかにすると計画した。そこで2022年度にはまず、マウスの蝸牛組織から、微細な内部構造を剖出するための実験系を立ち上げた。当研究の分担者の大道亮太郎は2018年から2020年まで、米国アイオワ大学のMolecular Otolaryngology and Renal Research Laboratoriesで、マウスの蝸牛組織から、感覚上皮や有毛細胞を剖出する実験を経験してきたが、この時にもちいていたのとほぼ同じ機材（実体顕微鏡LEICA　M205C）を我々の研究室に導入して実験系を再現した。2022年の秋までの段階で、未固定のマウスの蝸牛組織から内部構造を剖出する実験に成功し、例えばらせん神経節ニューロンのみを切り出して、DNA（クロマチンDNA）を抽出することなどが可能であった。また、感覚上皮での遺伝子発現を検討するための準備として、マウス蝸牛組織全体から抽出したRNAを用いて遺伝子発現解析をおこなった。2022年度には強大音響暴露による難聴を発症した直後（3時間後）の、自然免疫応答に関係する遺伝子発現を検討した。これまでの先行研究で、難聴発症3時間後にはFkbp5の発現が増加すると、DNAマイクロアレイや次世代シークエンサーの実験で明らかにしていたが、これをより定量性の高いリアルタイムRT-PCRの実験で確認した。リアルタイムRT-PCRでは、難聴発症3時間後には、発症前にくらべてFkbp5の発現が約3倍に増加していた。（3.01±0.75　vs　1.02±0.22、P＜0.01 by Mann-Whitney U-test）。

在这项研究中，我们计划阐明与先天免疫反应相关的基因（包括 Fkbp5 和 Atf3）的表达如何在感觉上皮（毛细胞和支持细胞）等耳蜗组织中受到控制。因此，在2022年，我们首先建立了一个实验系统来解剖小鼠耳蜗组织的微小内部结构。 2018年至2020年，该研究的共同作者Ryotaro Daimichi在美国爱荷华大学分子耳鼻喉和肾脏研究实验室进行了解剖小鼠耳蜗组织的感觉上皮和毛细胞的实验。将当时使用的几乎相同的设备（LEICA M205C体视显微镜）引入我们的实验室并重现了实验系统。到 2022 年秋天，我们已经成功地进行了解剖未固定的小鼠耳蜗组织内部结构的实验，使得仅切除螺旋神经节神经元并提取 DNA（染色质 DNA）成为可能。此外，为了准备检查感觉上皮中的基因表达，我们使用从整个小鼠耳蜗组织中提取的RNA进行了基因表达分析。在2022财年，我们研究了因暴露于强噪音而导致听力损失后（3小时后）与先天免疫反应相关的基因的表达。先前的研究通过 DNA 微阵列和下一代测序仪实验表明，Fkbp5 表达在听力损失发生 3 小时后增加，但这一点通过更多的定量实时 RT-PCR 实验得到了证实。实时RT-PCR显示，听力损失发生后3小时，Fkbp5的表达量比听力损失发生前增加了约三倍。（曼-惠特尼 U 检验为 3.01±0.75 与 1.02±0.22，P<0.01）。