聴覚と平衡覚を担う内耳感覚上皮の形成とその配置の分子機構の解明

阐明负责听力和平衡的内耳感觉上皮形成和排列的分子机制

基本信息

批准号：
19K07273
负责人：
佐藤滋
金额：
$ 2.75万
依托单位：
Jichi Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2019
资助国家：
日本
起止时间：
2019-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

内耳有毛細胞が特異的に標識されるAtoh1-EGFPマウス胚より蝸牛有毛細胞を単離し、ATAC-seq解析を行うことでSix1遺伝子周辺に同定した7種類のオープンクロマチン領域（ATAC1～ATAC7）の解析を行った。ATAC1とATAC2は進化的に保存されたエンハンサー21とエンハンサー12を含んでいる。エンハンサー21は、内耳形成過程において、耳プラコードから転写を活性化し、内耳の原基である耳胞の段階まで転写を活性化する。一方、エンハンサー12は形成された耳胞の腹側で転写を活性化する。まず、これら7種類のエンハンサーにLacZ遺伝子を連結したレポータープラスミドを用いて、内耳形成後期におけるエンハンサー活性の検出を試みた。胎生13.5日マウス胚より蝸牛管上皮を取り出し、一晩培養した蝸牛管上皮にエレクトロポレーションによりレポータープラスミドの導入を試みた。ATAC1～7のいずれについても有毛細胞特的なエンハンサー活性を検出できていない。導入・培養方法の改善、HSV-TK以外のプロモーターの検討を進めている。次に、理研BRC・天野孝紀先生との共同研究により、ATAC1とATAC2を単独または二重で欠失するエンハンサー欠失マウスの解析を行った。ATAC1、ATAC2、ATAC1/2二重欠失マウス明らかな形態や行動の異常は見られなかったが、ATAC1/2二重欠失マウスは重篤な行動異常を示すことがわかった。二重欠失マウスは頭部をくり返し上げる動作（head tossing）と旋回行動（circling）を示し、内耳機能の異常が強く示唆された。成体マウスの内耳を取り出して観察しところ、内耳が小さく、正常な形態の蝸牛が存在しないこともわかった。内耳の形態異常について、より詳細な解析を進めている。

通过从 Atoh1-EGFP 小鼠胚胎中分离耳蜗毛细胞并进行 ATAC-seq 分析，鉴定出 Six1 基因周围的七种开放染色质区域（ATAC1 至 ATAC7），其中内耳毛细胞被特异性标记。 ATAC1 和 ATAC2 包含进化保守的增强子 21 和 12。增强子 21 在内耳形成过程中激活耳基板的转录，直至耳囊阶段，耳囊是内耳的原基。另一方面，增强子 12 激活已形成的耳囊腹侧的转录。首先，我们尝试使用报告质粒检测内耳形成后期的增强子活性，其中 LacZ 基因与这七种增强子连接。从13.5天龄的小鼠胚胎中取出耳蜗管上皮，并通过电穿孔将报告质粒引入培养过夜的耳蜗管上皮中。未检测到任何 ATAC1-7 的毛细胞特异性增强子活性。我们目前正在努力改进引入和培养方法，并研究HSV-TK以外的启动子。接下来，我们与 RIKEN BRC 的 Takanori Amano 博士合作，分析了单一或双重缺乏 ATAC1 和 ATAC2 的增强子缺陷小鼠。 ATAC1、ATAC2、ATAC1/2双缺失小鼠未表现出明显的形态或行为异常，但ATAC1/2双缺失小鼠却表现出严重的行为异常。双缺失小鼠表现出摇头和转圈行为，强烈表明内耳功能异常。当取出成年小鼠的内耳进行观察时，发现内耳很小，并且形状正常的耳蜗也缺失了。我们目前正在对内耳的形态异常进行更详细的分析。

项目成果

期刊论文数量（2）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

SIX1 cooperates with RUNX1 and SMAD4 in cell fate commitment of Müllerian duct epithelium

SIX1与RUNX1和SMAD4合作参与M的细胞命运决定

DOI：
10.1038/s41418-020-0579-z
发表时间：
2020
期刊：
影响因子：
12.4
作者：
Jumpei Terakawa; Vanida A Serna; Devi M Nair; Shigeru Sato; Kiyoshi Kawakami; Sally Radovick; Pascal Maire; Takeshi Kurita
通讯作者：
Takeshi Kurita

Regulation of Six1 expression during hair cell development in the inner ear

内耳毛细胞发育过程中 Six1 表达的调节