内耳への経正円窓的遺伝子導入法の開発

开发内耳转圆窗基因转移方法

• 批准号: 18791207
• 负责人: 前田 幸英
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Okayama University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18791207/
• 关键词: 遺伝子治療; 難聴; 蝸牛; ギャップ結合タンパク; GJB2; 感音難聴; 正円窓; GJB2R75W; リポソーム; 免疫染色

【はじめに・目的】内耳への外来遺伝子導入法の確立は、めまい・難聴に対する遺伝子治療の発展にとっても、内耳に発現する遺伝子の機能解析にとっても、不可欠な課題である。しかし、こうして投与された外来遺伝子がどの様に聴力に影響を与え、またそれがいつまで持続するのかという問題についてはほとんど検討されていない。今回、我々はマウスの正円窓膜経由で外来遺伝子を導入し、遺伝子発現の認められる部位と時間経過、さらには生理学的な機能である聴力の変化を検討して、内耳への遺伝子導入法の基礎データについての報告を行った。【材料・方法】GJB2R75W変異は、ヒトでは内耳に発現して優性遺伝性難聴を引き起こすことが知られている遺伝子変異であり、単独のアレルでも難聴を引き起こすことができる。本研究では、外来性のGJB2R75Wを機能検査のためのマーカー遺伝子として内耳に導入して、発現の認められる部位と時間経過について検討した。マウスをケタミンで麻酔し、正円窓膜上にGJB2R75W-eGFP 変異遺伝子を発現するプラスミドベクターをリボソームとしておく。薬剤投与後1、2、3、5、あるいは12日後に、動物を同様に麻酔し、クリック音に対する聴性脳幹反応の闘値を測定する。データは各時間経過、実験条件ごとに8-10サンプル採取し、ノンパラメトリック検定によって、pGJB2R75W-eGFP 投与による聴力の変化を解析した。【結果】処置後3日目の免疫染色では、GJB2(R75W)-eGFP の発現は、蝸牛内で確認でき、特にinner および outerpillar cells, outer hair cells, Claudius cells さらにthe spiral limbusとligamentで認められた。遺伝子投与による聴力の低下は、処置後1日目から見られ、3日目まで持続したが、5日後には前値と同程度まで聴力は改善した。これの結果から、GJB2(R75w)は成熟した蝸牛に、一過性の機能的低下を引き起こすことが可能であり、これは経正円窓投与による外来遣伝子投与によっても引き起こすことが訂能であると考えられた。【意義】この研究によって難聴の遣伝子治療についての基礎的知見が得られた。

[引言/目的]建立将外源基因导入内耳的方法是发展眩晕和听力损失基因治疗以及内耳表达基因功能分析的重要课题。然而，关于这些外源基因如何影响听力以及这种影响持续多长时间的研究还很少。在这项研究中，我们通过圆窗膜将外源基因导入小鼠体内，研究了基因表达的部位和时间过程，并检查了听力这一生理功能的变化，并确定了如何将基因导入小鼠体内。我们报告了基本数据。 [材料/方法] GJB2R75W突变是一种在内耳中表达的基因突变，已知会导致人类显性遗传性听力损失，甚至单个等位基因也可能导致听力损失。在本研究中，我们将外源性GJB2R75W引入内耳作为功能测试的标记基因，并检查表达的位置和时间过程。用氯胺酮麻醉小鼠，将表达 GJB2R75W-eGFP 突变基因的质粒载体作为核糖体放置在圆窗膜上。在给药后 1、2、3、5 或 12 天，对动物进行类似的麻醉，并测量听性脑干对咔嗒声的阈值反应。每个时间过程和每个实验条件收集8-10个数据样本，并使用非参数测试分析由于pGJB2R75W-eGFP施用引起的听力变化。 [结果]治疗后第3天免疫染色显示，耳蜗中有GJB2(R75W)-eGFP表达，尤其是内、外柱细胞、外毛细胞、Claudius细胞、螺旋缘和韧带。基因注射导致的听力损失从治疗后第一天开始一直持续到第三天，但5天后听力改善到与之前相同的水平。这些结果表明GJB2(R75w)可以引起成熟耳蜗的短暂功能下降，并且这也可以由经口圆窗施用的外源基因施用引起。 [意义]本研究为听力损失基因治疗提供了基础知识。

项目成果

Cochlear expression of a dominant-negative GJB2R75W construct delivered through the round window membrane in mice.

通过圆窗膜在小鼠体内传递显性失活 GJB2R75W 构建体的耳蜗表达。

• 发表时间: 2007
• 作者: Maeda Y; Fukushima K; Kawasaki A; Nishizaki K; Smith RJ.
• 通讯作者: Smith RJ.

ここまでわかった遺伝子異常 先天性難聴

迄今为止我们了解到的遗传异常：先天性听力损失

• 发表时间: 2006
• 作者: 前田幸英; 福島邦博; 西崎和則
• 通讯作者: 西崎和則