GABA-A受容体パルミトイル化によるベンゾジアゼピン系薬剤耐性メカニズムの解明

GABA-A受体棕榈酰化阐明苯二氮卓类药物耐药机制

基本信息

批准号：
22K09086
负责人：
下山修司
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Hirosaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

パルミトイル化予測ツールを用いた結果、当初標的としていたβ3サブユニットのシステイン残基(C313)だけではなく、別のシステイン残基(それぞれC23及びC24)もパルミトイル化される可能性が示唆された。これを踏まえ、これらのシステイン残基をアラニンに置換した変異体を作製し、その細胞内局在を解析した。その結果、C23とC24でも細胞膜での発現が著しく減少しており、チャネルとしても機能できないことがわかった。一方、C313変異体では、細胞膜での発現が低いもののチャネルとして機能できていることがわかった。しかしながら、GABAに対する感受性が著しく減少していたことから、C313は細胞内の局在だけではなく、チャネル特性にも関与していることが示唆された。また、これらのシステイン残基はタンパク質の立体構造に重要なジスルフィド結合とは関係がなく、AlphaFold2による構造予測を行っても野生型とはほとんど差がないため、変異体によるコンフォメーションの変化は最小限度であると考えられる。そのため変異体の分布と機能の変化は、パルミトイル化されなくなった結果だと言える。以上の結果より、GABA受容体のβ3サブユニットはパルミトイル化されることで、細胞膜に発現して、受容体として機能することが示唆された。今後は、細胞膜に移行せずに細胞内のどこに蓄積しているのか、パルミトイル化に関わる酵素の同定を行うとともに、これらの結果が細胞レベルではなく個体でも起きている現象なのか、を明らかにしていく。これらの研究を推進することで、細胞膜における発現低下を原因とするベンゾジアゼピン系化合物の効果減弱メカニズムを明らかにすることができ、効果が減弱しない薬剤の開発に繋げることができる。

使用棕榈酰化预测工具的结果表明，不仅最初靶向的β3亚基的半胱氨酸残基（C313），而且其他半胱氨酸残基（分别为C23和C24）也可能被棕榈酰化。。基于此，我们创建了这些半胱氨酸残基被丙氨酸取代的突变体，并分析了它们的细胞内定位。结果，我们发现细胞膜中C23和C24的表达显着减少，并且它们无法发挥通道功能。另一方面，C313突变体被发现能够发挥通道的功能，尽管它在细胞膜中的表达较低。然而，对 GABA 的敏感性显着降低，表明 C313 不仅参与细胞内定位，还参与通道特性。另外，这些半胱氨酸残基与二硫键无关，而二硫键对于蛋白质的三维结构很重要，即使通过AlphaFold2预测结构，也与野生型几乎没有区别，因此构象变化由突变体引起的影响很小，这被认为是极限。因此，突变体分布和功能的变化可以说是棕榈酰化缺失的结果。上述结果表明GABA受体的β3亚基通过棕榈酰化在细胞膜上表达并作为受体发挥功能。将来，我们将确定它在细胞中的何处积累而不转移到细胞膜，识别参与棕榈酰化的酶，并澄清这些结果是否不仅发生在细胞水平，而且还发生在个体水平。我走了。通过促进这些研究，我们将能够阐明由于细胞膜表达减少而降低苯二氮卓类化合物的作用的机制，这将导致开发不降低其作用的药物。