動脈硬化発症プロセスにおける一酸化窒素修飾がもたらすエンドセリン受容体機能の検討

动脉粥样硬化发展过程中一氧化氮修饰带来的内皮素受体功能检测

基本信息

批准号：
22K08203
负责人：
林宏樹
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08203/
关键词：
エンドセリン受容体動脈硬化翻訳後修飾慢性炎症

项目摘要

超高齢化社会とともに動脈硬化患者は増加しており、早期の治療介入または予防を目指すために動脈硬化の初期発症メカニズムの解明は重要である。エンドセリン受容体はGタンパク共役型受容体（GPCR）であり、動脈硬化初期段階における内皮機能障害との関連が報告されている。GPCRの重要なアダプター分子として知られているβアレスチンは炎症時に誘導される一酸化窒素により翻訳後修飾（S-ニトロシル化）されシグナルを調節し、GPCRシグナルを調節している。本検討においてエンドセリン受容体において慢性炎症により誘導される翻訳後修飾のもたらす機能調節について解析を行う。In vitroでの解析のためHEK293細胞においてエンドセリン受容体の安定発現株の樹立を行った。プラスミドを細胞内に導入して、薬剤でのセレクションを行いHEK293エンドセリン受容体安定発現株を数クローン得た。エンドセリンで樹立した細胞を刺激し、ERKのリン酸化をウエスタンブロットで確認すると通常のHEK293より増強されたシグナルが得られた。また局在を免疫染色で確認した。安定発現しているエンドセリン受容体はFlagタグがあるため、Flag抗体により免疫染色を行うと、細胞膜に局在していることが確認できた。またエンドセリンで刺激を行うと細胞質に内在化した。このようにHEK293細胞で機能するエンドセリン受容体の安定発現株ができた。この安定発現株を用いて今後の解析を引き続き行う。

随着社会老龄化，动脉硬化患者数量不断增加，阐明动脉硬化早期发生的机制对于早期治疗干预或预防具有重要意义。内皮素受体是 G 蛋白偶联受体 (GPCR)，据报道与动脉粥样硬化早期的内皮功能障碍有关。 β-arrestin被称为GPCRs的重要衔接分子，通过炎症过程中诱导的一氧化氮进行翻译后修饰（S-亚硝基化）并调节信号，从而调节GPCR信号。在本研究中，我们将分析慢性炎症诱导的翻译后修饰引起的内皮素受体的功能调节。为了进行体外分析，在 HEK293 细胞中建立了稳定表达内皮素受体的细胞系。将质粒导入细胞，通过药物筛选获得数个HEK293内皮素受体稳定表达细胞克隆。当用内皮素刺激建立的细胞并通过蛋白质印迹证实ERK的磷酸化时，获得了与正常HEK293相比增强的信号。还通过免疫染色证实了定位。由于稳定表达的内皮素受体具有 Flag 标签，因此使用 Flag 抗体进行免疫染色证实其位于细胞膜中。此外，在用内皮素刺激后，它被内化到细胞质中。通过这种方式，创建了在 HEK293 细胞中稳定表达内皮素受体的细胞系。未来的分析将继续使用这种稳定表达菌株。