ミトコンドリアからリソソームへの特異的な活性酸素シグナル伝達機構

从线粒体到溶酶体的特定活性氧信号传导机制

基本信息

批准号：
22K06205
负责人：
橋爪脩
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06205/
关键词：
マグネシウム活性酸素種ミトコンドリアリソソーム TRPML 酸性環境

项目摘要

本研究では、細胞内のマグネシウムを排出するトランスポーターであるCNNMの抑制や、CNNMと結合することでマグネシウム排出活性を抑制する分子であるPRLの過剰発現によるリソソームエキソサイトーシス亢進のメカニズムを明らかにすることを目的としている。CNNMの抑制により細胞内でマグネシウが過剰蓄積し、それによりミトコンドリアで活性酸素種が過剰産生されるが、その活性酸素種がどのようにリソソームに影響するのか、オルガネラを超えた活性酸素種シグナル伝達が行われていることが考えられるが、その仕組みは明らかになっていない。PRL過剰発現した細胞は細胞外が酸性化した環境に適応して増殖を行うようになり、この適応にリソソームエキソサイトーシスの亢進が重要であることを明らかにしている。そこで、PRLを過剰発現した細胞の酸性環境への適応にどのような遺伝子が重要なのかを明らかにするために、Crispr-Cas9 sgRNAライブラリーを用いたゲノムスワイドなスクリーニングを行った。PRL発現により酸性環境に適応した細胞は逆に塩基性条件での生存がコントロール細胞に比較して顕著に低下する。このため、塩基性条件で生存が回復する細胞を選択し、生き残った細胞に導入されているsgRNAを調べた。このスクリーニングにより４６遺伝子がPRL発現による酸性環境への適応に関わる遺伝子の候補として挙がった。現在はこれらの遺伝子の中から、重要と思われるものや転写制御に関わるものをピックアップし、さらなる解析のためにノックアウト細胞の樹立を試みている。

在本研究中，我们阐明了通过抑制CNNM（一种排出细胞内镁的转运蛋白）以及通过过表达PRL（一种通过与CNNM结合来抑制镁排泄活性的分子）来增强溶酶体胞吐作用的机制。抑制 CNNM 会导致细胞内镁的过度积累，从而导致线粒体中活性氧的过量产生。活性氧如何影响细胞器内的活性氧信号传导？这种情况有可能发生，但机制尚不清楚。过度表达 PRL 的细胞适应细胞外酸性环境并增殖，并且已经清楚增强的溶酶体胞吐作用对于这种适应很重要。因此，我们使用 Crispr-Cas9 sgRNA 文库进行了全基因组筛选，以阐明哪些基因对于 PRL 过表达细胞适应酸性环境至关重要。相反，通过PRL表达适应酸性环境的细胞在碱性条件下的存活率明显低于对照细胞。因此，我们选择了在碱性条件下恢复存活的细胞，并检查了导入存活细胞中的sgRNA。通过这次筛选，确定了 46 个基因作为通过 PRL 表达参与适应酸性环境的候选基因。目前，我们正在从这些基因中选择被认为重要或参与转录调控的基因，并尝试建立敲除细胞以进行进一步分析。