反応性アストロサイト制御分子PAK2キナーゼの機能解析

反应性星形胶质细胞调节分子PAK2激酶的功能分析

基本信息

批准号：
21K06598
负责人：
小椋正人
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Fukushima Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

代謝に伴うROS発生については、神経変性疾患をはじめとする種々の加齢性疾患の発症要因の一つとされている。申請者はこれまでミトコンドリアc-Srcによる呼吸鎖複合体IIのsuccinate dehydrogenase A (SDHA)サブユニットの215番目のチロシンリン酸化がROS産生の抑制に必須の役割を持つことを見出してきた。さらに、アストロサイト群特異的に代謝性ROSの増加を示すSDHAY215Fリン酸化部位変異体発現トランスジェニック（Tg）マウスを作出し、運動協調性の低下、黒質におけるグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）、A1アストロサイトマーカーC3および神経毒性因子Tinagl1分子陽性細胞数の増加とチロシン水酸化酵素（TH）陽性神経細胞の減少を引き起こすことを見出した。本研究では、代謝性ROSに起因する反応性アストロサイトによるドパミン神経損傷メカニズムの解明を目的として、アストロサイト由来分泌因子Tinagl1の発現調節メカニズムの解析を行った。マウスTinagl1プロモーターをクローニングした後、ルシフェラーゼ発現ベクターに組込んだ。プロモーター領域の生物データベース解析から複数の転写因子が発現調節に関わることが示唆された。プロモーター領域のデリーション変異体および部分配列変異体を作製し、レポーターアッセイを行ったところ、p53結合領域がTinagl1発現調節に重要な役割を果たしていることが判明した。p53をターゲットとするsiRNAを用いた発現抑制実験を行い、p53がTinagl1発現に関わることを確認した。さらに、In vitroキナーゼアッセイおよびウエスタンブロットを行い、PAK2がp53のリン酸化および安定化に関わることを見出した。これらの解析から反応性アストロサイトにおいてp53を介するPAK2の新規シグナル経路の存在が明らかとなった。

与新陈代谢相关的ROS的产生被认为是包括神经退行性疾病在内的各种与年龄相关的疾病的原因之一。申请人之前已发现线粒体c-Src对呼吸链复合物II的琥珀酸脱氢酶A(SDHA)亚基的215位上的酪氨酸进行磷酸化在抑制ROS产生中发挥重要作用。此外，我们生成了表达 SDHAY215F 磷酸化位点突变体的转基因（Tg）小鼠，该突变体特异性增加了星形胶质细胞组中的代谢 ROS，导致运动协调性下降，黑质中的胶质纤维酸性蛋白（GFAP），我们发现 A1 导致了星形胶质细胞标记物 C3 和神经毒性因子 Tinagl1 分子呈阳性的细胞数量，以及酪氨酸羟化酶 (TH) 阳性神经元的减少。本研究分析了星形胶质细胞源性分泌因子Tinagl1的表达调控机制，旨在阐明代谢性ROS引起反应性星形胶质细胞引起多巴胺能神经损伤的机制。克隆小鼠 Tinagl1 启动子后，将其整合到荧光素酶表达载体中。启动子区域的生物数据库分析表明多种转录因子参与表达调控。通过创建启动子区的缺失突变体和部分序列突变体并进行报告基因检测，我们发现p53结合区在调节Tinagl1表达中发挥着重要作用。我们使用靶向 p53 的 siRNA 进行了表达抑制实验，并证实 p53 参与 Tinagl1 表达。此外，我们进行了体外激酶测定和蛋白质印迹，发现PAK2参与p53的磷酸化和稳定。这些分析揭示了反应性星形胶质细胞中存在一种新的 p53 介导的 PAK2 信号通路。