膜結合型酵素によるグレリン活性化機構の解明

阐明膜结合酶激活生长素释放肽的机制

• 批准号: 22K06117
• 负责人: 椎村 祐樹
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kurume University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06117/
• 关键词: グレリンOアシルトランスフェラーゼ; グレリン; アシルトランスフェラーゼ; 構造解析

本年度は、GOAT発現系の確立を試みた。発現系候補としてまず、これまでグレリン受容体の発現などで活用してきたBac-to-Bac system (invitorogen) を選択した。ヒトGOAT遺伝子を組込んだバキュロウイルスを作製して、昆虫細胞であるSf9細胞でGOATを発現させた。その後、GOATに付与したGFPを指標にしてCell analyzerによって発現量を確認したが、発現量は著しく低かった。そこで感染量や感染時間を変えながら発現を試みたが、発現量を増加させることができなかった。またわずかに発現したGOATをHisタグ精製してゲル濾過クロマトグラフィーに供したが、GOATのピークを確認することができなかった。この理由として、Bac-to-Bac systemがGOATの発現に適していない可能性が考えられた。そこで、発現系を浮遊系哺乳類細胞であるExpi293 system (invitrogen) に変更した。細胞には、テトラサイクリン系抗生剤の添加によって発現が誘導される様に遺伝子改変されているExpi293F inducible細胞を用いた。Transfectionの条件を検討ののち、50 mLの小スケールでGOATを発現させるとGFPの蛍光が確認できた。そこでこの発現タンパク質をNi精製して、蛍光クロマトグラフィーに供した。しかしながらGOATのピークを確認することはできなかった。

今年，我们尝试建立GOAT表达系统。作为候选表达系统，我们首先选择了 Bac-to-Bac 系统（invitrogen），该系统已用于表达 ghrelin 受体。我们创建了一种含有人类 GOAT 基因的杆状病毒，并在昆虫 Sf9 细胞中表达 GOAT。此后，使用以附着于GOAT的GFP作为指示剂的细胞分析仪确认表达水平，但表达水平极低。因此，我们尝试通过改变感染剂量和感染时间来增加表达，但我们无法增加表达水平。此外，使用His标签纯化微量表达的GOAT并进行凝胶过滤色谱，但无法确认GOAT峰。其原因被认为是 Bac-to-Bac 系统不适合 GOAT 表达。因此，我们将表达系统改为Expi293系统（invitrogen），这是一种悬浮哺乳动物细胞系统。使用Expi293F诱导型细胞作为细胞，该细胞经过基因修饰，通过添加四环素抗生素来诱导表达。检查转染条件后，GOAT 在 50 mL 的小规模中表达，并确认 GFP 荧光。因此，用Ni纯化该表达的蛋白质并进行荧光层析。然而，无法确认 GOAT 的峰值。