Cryo-EM structure of the ghrelin receptor coupled to an engineered heterotrimeric G protein

与工程化异三聚体 G 蛋白偶联的生长素释放肽受体的冷冻电镜结构

• 批准号: 20KK0359
• 负责人: 椎村 祐樹
• 金额: $ 8.99万
• 依托单位: Kurume University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (A))
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021 至 2023
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-20KK0359/
• 关键词: グレリン受容体; GPCR; Cryo-EM; 立体構造

本年度は、アナモレリンが結合したグレリン受容体の構造解析を中心に研究を進めた。これまでの研究で良好な精製タンパク質粒子が得られていることがわかっていたので、大阪大学の300 keV電子顕微鏡Kriosでサンプル粒子を取得した。画像解析の結果、2.9オングストローム分解能で構造決定することができた。さらに得られた構造情報をもとにアナモレリンから4オングストローム以内にあるグレリン受容体の17のアミノ酸を抽出してアラニンに変異させた。このグレリン受容体変異体を用いてアナモレリン添加時のカルシウムシグナル活性を測定することにより結合に重要なアミノ酸の同定を試みた。その結果、Asp99、Arg102、Lue103、Gln120、Glu124、Ile178、Phe279、Arg283、Phe286、Asn305およびPhe309といった複数のアミノ酸点変異体でシグナル活性の減弱が確認された。次にアナモレリン結合構造と構造既知のグレリン受容体と比較したところ、アゴニストであるグレリンやイブタモレン、GHRP6結合構造と構造上の違いはほとんど見られず、構造新規性は低かった。そこで、渡米中に知り合ったSanford Researchの増保先生にお願いして、BRET活性によるシグナルアッセイを行って頂いた。増保先生のシグナルアッセイ系では、構造変化に起因するシグナル変化を測定することができる。その結果、アナモレリンは内因性アゴニストであるグレリンよりも作用の強い、「スーパーアゴニスト」であることがわかり、現在、論文執筆中である。

今年，我们的研究重点是阿拉莫林结合的生长素释放肽受体的结构分析。由于之前的研究表明已经获得了纯化良好的蛋白质颗粒，因此使用大阪大学的 Krios 300 keV 电子显微镜获得了样品颗粒。通过图像分析，我们能够确定分辨率为 2.9 埃的结构。此外，根据获得的结构信息，他们提取了位于阿拉莫林4埃以内的生长素释放肽受体的17个氨基酸，并将其突变为丙氨酸。使用这种生长素释放肽受体突变体，我们尝试通过测量添加阿拉莫林后的钙信号活性来鉴定对于结合重要的氨基酸。结果，在Asp99、Arg102、Lue103、Gln120、Glu124、Ile178、Phe279、Arg283、Phe286、Asn305和Phe309等多个氨基酸点突变体中确认了信号活性减弱。接下来，我们将阿拉莫林结合结构与已知的ghrelin受体结构进行了比较，发现激动剂ghrelin、伊布莫伦与GHRP6结合结构之间结构差异不大，结构新颖性较低。因此，我请我在美国旅行期间认识的Sanford Research的Masuyasu博士进行了基于BRET活性的信号测定。 Masuho博士的信号分析系统可以测量结构变化引起的信号变化。结果发现，阿拉莫林是一种“超级激动剂”，其作用比内源性激动剂胃饥饿素更强，目前正在撰写一篇论文。

项目成果

Structure of an antagonist-bound ghrelin receptor reveals possible ghrelin recognition mode

拮抗剂结合的生长素释放肽受体的结构揭示了可能的生长素释放肽识别模式

• DOI: 10.1038/s41467-020-17554-1
• 发表时间: 2020-08-19
• 期刊: Nature Communications
• 影响因子: 16.6
• 作者: Y. Shiimura;S. Horita;Akie Hamamoto;H. Asada;K. Hirata;Misuzu Tanaka;K. Mori;Tomoko Uemura
• 通讯作者: Tomoko Uemura

循環器内科

心脏病学

• 发表时间: 2022
• 作者: 佐藤貴弘;井田隆徳;椎村祐樹;児島将康
• 通讯作者: 児島将康