ＧＯＡＴ及びグレリン受容体の立体構造に基づいたグレリン脂肪酸修飾・認識機構の解明

基于GOAT和ghrelin受体三维结构阐明ghrelin脂肪酸修饰和识别机制

基本信息

批准号：
14J06159
负责人：
椎村祐樹
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyoto University (2015)Kurume University (2014)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-25 至 2016-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14J06159/
关键词：
GPCR グレリン構造解析 X線構造解析グレリン受容体

项目摘要

今年度はグレリン受容体の結晶構造解析に向けて、熱安定化変異体のスクリーニングおよび新規化合物による安定化効果のスクリーニング、精製グレリン受容体の結晶化に取り組んだ。これまでグレリン受容体の結晶化に成功していない理由として、グレリン受容体自身の基礎活性が非常に高いため、安定性が低く精製が困難であることが考えられた。そこで、受容体のさらなる安定化を図るために出芽酵母を用いた変異体スクリーニングを行った。その結果、受容体の安定性を向上させる新たな点変異を3箇所見出した。この結果をもとに、発現宿主を昆虫細胞に変更し、大量培養およびアフィニティーカラムによる精製を行ったところ、これらの変異体はこれまでのコンストラクトと比較して発現量も高く、再現よく精製できることが確認された。加えて、受託合成によってさらに2種類のグレリン受容体阻害剤を入手した。これらの阻害剤とこれまでの精製・結晶化で使用していた市販の阻害剤との熱安定性について比較検討したところ、新規阻害剤では、いずれも熱安定性が5度以上上昇することが確認された。現在、これらの検討に基づいて精製グレリン受容体の結晶化を試みているが、これまでのところ結晶は得られていない。今後、結晶化の条件などについて細かく検討していく必要があると考えられるが、変異体のスクリーニングおよび新規阻害剤の作製によってグレリン受容体の安定化を図れたことは研究全体を通して大きな成果であり、研究は着実に進展しているものと考えられる。

今年，为了分析ghrelin受体的晶体结构，我们开展了热稳定突变体的筛选、新化合物的稳定作用筛选以及纯化的ghrelin受体的结晶工作。迄今为止ghrelin受体结晶尚未成功的原因被认为是ghrelin受体本身具有非常高的基础活性，使其不稳定且难以纯化。因此，为了进一步稳定受体，我们利用酿酒酵母进行了突变体筛选。结果，他们发现了三个新的点突变，可以提高受体的稳定性。基于这些结果，我们将表达宿主改为昆虫细胞，并使用亲和柱进行大量培养和纯化，我们发现这些突变体具有比以前的构建体更高的表达水平，并且可以以高再现性进行纯化。此外，还通过合同合成获得了另外两种ghrelin受体抑制剂。当我们将这些抑制剂的热稳定性与常规纯化和结晶中使用的市售抑制剂进行比较时，我们发现新型抑制剂的热稳定性提高了5度以上。我们目前正在尝试根据这些研究结晶纯化纯化的ghrelin受体，但迄今为止尚未获得晶体。尽管未来有必要详细检查结晶条件，但通过突变体筛选和新抑制剂的创建来稳定生长素释放肽受体是整个研究的一项重大成就，研究被认为正在稳步进展。