Functional analysis of clock gene orthologues in plant-associated bacteria in the phyllosphere and rhizosphere

叶际和根际植物相关细菌时钟基因直系同源物的功能分析

基本信息

批准号：
22K05394
负责人：
井口博之
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Kyoto University of Advanced Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K05394/
关键词：
概日時計植物共生細菌時計遺伝子環境応答

项目摘要

日周変動と関わりが深い植物環境に生息する細菌において、時計遺伝子（kai遺伝子）オルソログの機能解明を目指している。これまでに葉面細菌Methylobacterium extorquensが2コピー持つkaiCがストレス耐性を制御し、葉上の生育に寄与することを明らかにしてきた。本研究では、M. extorquensに加えて根粒菌M. nodulansを用い、多様な環境因子が存在する植物環境（葉上・根上）におけるkai遺伝子の機能解明、および制御遺伝子kaiRやkaiKを含めたkai制御系の制御機構の解明を目指す。それにより、植物上での生育に係る微生物機能や時計遺伝子の機能進化について理解を深化させる。今年度は以下の研究に取り組んだ。(1)kaiC遺伝子の葉上での発現レベル：　　in vitro実験ではM. extorquensのkaiCが青色光や熱に転写応答することが分かっているが、葉上でいつ機能しているか不明である。機能の指標を、kaiC遺伝子発現レベルとKaiCタンパクのリン酸化レベルと考えた。まずkaiCプロモーターにレポーター遺伝子を連結したレポーター系を導入した本菌をシロイヌナズナに接種し、一日（昼夜サイクル）の中での発現レベルを解析した。(2)kai遺伝子を介した制御機構：　　M. extorquensにおいて、KaiRのKaiCリン酸化への影響を調べるため、遺伝子破壊株についてPhos-tag SDS-PAGEを行った。またM. nodulansにおいてはkaiC破壊株とkaiK破壊株の構築を進めた。(3)kaiC遺伝子の時計機能：　　M. extorquensのkaiCが時計機能を有するのか調べるため、レポーター系を用いた経時モニタリングにより遺伝子発現レベルを測定し、遺伝子発現の概日リズムが生じる培養条件を探索した。

我们的目标是阐明生活在与昼夜波动密切相关的植物环境中的细菌中时钟基因（kai 基因）的直向同源物的功能。到目前为止，我们已经证明，在叶面细菌扭扭甲基杆菌中有两个拷贝的 kaiC 可以控制胁迫耐受性并有助于叶子的生长。在本研究中，我们使用根瘤菌M. nodulans和M. extorquens来阐明kai基因在存在多种环境因素的植物环境（叶和根）中的功能，并研究kai基因的功能，包括调控基因kaiR和kaiK旨在阐明控制系统的控制机制。这将加深我们对与植物生长相关的微生物功能和时钟基因功能进化的理解。今年，我们开展了以下研究。 (1)kaiC基因在叶片上的表达水平：体外实验表明，M. extorquens的kaiC对蓝光和热有转录反应，但其在叶片上的作用尚不清楚。我们将 kaiC 基因表达水平和 KaiC 蛋白磷酸化水平视为功能指标。首先，将导入有报告基因与kaiC启动子连接的报告系统的细菌接种到拟南芥中，分析一天中的表达量(昼夜循环)。 (2)kai基因介导的调控机制：为了研究KaiR对扭伤M. extorquens中KaiC磷酸化的影响，对基因破坏的菌株进行了Phos-tag SDS-PAGE。在结瘤分枝杆菌中，我们还构建了 kaiC 破坏的菌株和 kaiK 破坏的菌株。 (3) kaiC基因的时钟功能：为了研究M. extorquens的kaiC是否具有时钟功能，我们使用报告系统通过延时监测测量基因表达水平，并寻找产生基因昼夜节律的培养条件表达了。