Elucidation of the reaction mechanism of a novel non-heme diiron enzyme, alpha-aminoisobutyrate hydroxylase, and its application

新型非血红素二铁酶α-氨基异丁酸羟化酶反应机制的阐明及其应用

基本信息

批准号：
22K05389
负责人：
日比慎
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Toyama Prefectural University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

令和４年度は以下の研究項目を実施した。「A. 活性中心の解析」AibH1H2活性中心の分子構造を分析するために、立体構造解析を実施する。この解析のためには、高純度に精製されたAibH1H2タンパク質が必要であり、まずは組換え微生物の大量培養と各種クロマトグラフィーによるタンパク質精製を行った。得られたサンプルはSDS-PAGE上で高純度で精製できていることが確認され、以後の実験に使用するのに十分な品質であった。次いで立体構造を解析するためにクライオEM解析を行った。基質-酵素複合体の解析のために、AibH1H2と基質Aibの混合液を使用した。作成した酵素溶液は、KEKクライオ電顕施設で測定を行った。現在電顕データを解析中であり、構造情報が得られ次第、詳細な構造解析を実施する予定である。「B. タンパク質工学によるAibHYDの機能改変」AibH1H2変異体酵素を作成し、新しい産業用酸化触媒として利用できる酵素分子の開発を目指す。まずはAibHYD活性評価用菌株の最適な反応条件の検討を行った。具体的には、培養温度・誘導剤濃度と添加タイミング・基質濃度と添加タイミング・エネルギー分子の添加などの効果を検討し、最適な反応条件を決定した。次に既知のAibH1H2立体構造を使用したモデリング解析から想定される、基質結合部位を形成するアミノ酸残基を抽出し、変異導入のターゲットとした。変異体酵素を作製する方法として、幾つかの異なる部位特異的変異導入法を試したところ、最も効率よく変異を導入できる手法を決定することができた。また変異体酵素の解析に使用するAibのアナログ化合物に関して、まずは野生型酵素に対する反応性の評価を開始した。各種Aibアナログ化合物とその生成物をキラル分離分析できる分析系の検討も行っており、すでにLC-MS法を用いた分析法を確立している。

2020年度，我们进行了以下研究项目。 “A.活性中心分析” 为了分析AibH1H2活性中心的分子结构，我们将进行3D结构分析。对于该分析，需要高度纯化的 AibH1H2 蛋白，第一步是重组微生物的大量培养和使用各种层析方法的蛋白纯化。所获得的样品经SDS-PAGE证实高度纯化，并且具有足够的质量用于后续实验。接下来，进行冷冻电镜分析以分析三维结构。为了分析底物-酶复合物，使用 AibH1H2 和底物 Aib 的混合物。在 KEK 冷冻电子显微镜设施中测量制备的酶溶液。我们目前正在分析电子显微镜数据，并计划在获得结构信息后立即进行详细的结构分析。 “B.通过蛋白质工程对AibHYD进行功能修饰”我们的目标是创建AibH1H2突变酶并开发可用作新型工业氧化催化剂的酶分子。首先，我们研究了评估 AibHYD 活性的菌株的最佳反应条件。具体来说，我们研究了培养温度、诱导剂浓度和添加时间、底物浓度和添加时间、能量分子添加的影响，并确定了最佳反应条件。接下来，我们使用AibH1H2的已知3D结构，基于模型分析提取了形成底物结合位点的氨基酸残基，并将其用作突变引入的目标。在尝试了几种不同的定点诱变方法来创建突变酶后，我们能够确定引入突变的最有效方法。我们还开始评估用于分析突变酶与野生型酶的 Aib 类似化合物的反应性。我们还在研究一种可以对各种 Aib 类似化合物及其产物进行手性分离分析的分析系统，并且已经建立了使用 LC-MS 的分析方法。