膜結合型酵素の可溶性酵素化とプラズマローゲンライブラリー構築への応用

膜结合酶的可溶性酶化及其在缩醛磷脂文库构建中的应用

• 批准号: 22K04838
• 负责人: 岩崎 雄吾
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Chubu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K04838/
• 关键词: 融合タンパク; プラズマローゲン; 脂質; 酵素

微生物およびヒトPEDSのN末端側にMBPを、C末端側にApoAIを付加した発現プラスミドを構築し、融合タンパク質として大腸菌で発現を試みた。微生物PEDSは低温での発現誘導により細胞内に可溶性タンパクとして発現し、細胞破砕液の遠心分離上清から回収することができた。さらに回収した微生物PEDSをニッケルNTAアガロースにより精製できた。精製したPEDSのCDスペクトル測定の結果、本タンパクは一定の立体構造をとっていることが予想された。一方、ヒトPEDSのMBP-ApoAIとの融合タンパクは可溶性はおろか、不溶性タンパク質としても発現しなかった。抗MBP抗体を用いたウエスタンブロットの解析から、このヒトPEDS融合タンパクはN末端に付加したMBPまでは翻訳されるが、PEDS部分の途中で翻訳が停止していることが予想された。ヒトPEDSはそのN末部分が微生物PEDSと比較して長い。そこで、ヒトPEDSのN末端27アミノ酸残基を微生物PEDSの9アミノ酸残基に置き換えたキメラ遺伝子を作成し、前述のMBP/ApoAIとの融合フォーマットで発現させたところ、可溶性タンパクとして発現させることに成功した。可溶性タンパクとして発現させた微生物およびヒトPEDSを用いて、プラスマローゲン合成を試みた。本酵素は電子伝達体としてシトクロムB5(Cb5)と同還元酵素(B5R)を必要とする。別途可溶性タンパクとして発現調製したCb5とB5Rの存在下、有機合成したアルキルアシルリン脂質を基質として酵素反応をおこなったが、プラズマローゲンの合成は確認できなかった。さらにPEDS融合タンパクのN末端部分に付加したMBPをCb5と置き換えた発現プラスミドを新たに構築し、可溶性タンパクとして発現させることに成功したが、この酵素の活性も検出することはできなかった。

我们构建了微生物和人PEDS的N端添加MBP和C端添加ApoAI的表达质粒，并尝试将它们作为融合蛋白在大肠杆菌中表达。通过低温诱导表达，微生物PEDS在细胞内表达为可溶性蛋白，并且可以从细胞裂解物的离心上清液中回收。此外，回收的微生物 PEDS 可以使用镍 NTA 琼脂糖进行纯化。对纯化的PEDS进行CD光谱测量，结果预测该蛋白质具有一定的三维结构。另一方面，人PEDS与MBP-ApoAI的融合蛋白不表达为不溶性蛋白，更不用说可溶性蛋白了。根据使用抗MBP抗体的蛋白质印迹分析，预测该人PEDS融合蛋白翻译至添加至N末端的MBP，但翻译在PEDS部分的中途停止。人类 PEDS 的 N 端部分比微生物 PEDS 更长。因此，我们创建了一个嵌合基因，其中人PEDS的N端27个氨基酸残基被微生物PEDS的9个氨基酸残基取代，并以上述MBP/ApoAI融合形式表达成功。我们尝试使用微生物和表达为可溶性蛋白质的人类 PEDS 来合成缩醛磷脂。该酶需要细胞色素 B5 (Cb5) 和细胞色素 B5 还原酶 (B5R) 作为电子载体。在分别表达和制备为可溶性蛋白的Cb5和B5R存在下，使用有机合成的烷基酰基磷脂作为底物进行酶促反应，但不能证实缩醛磷脂的合成。此外，他们构建了一种新的表达质粒，其中PEDS融合蛋白N末端附着的MBP被Cb5取代，并成功将其表达为可溶性蛋白，但无法检测到该酶的活性。