連続複数塩基ランダム置換法の開発とホスホリパーゼDの機能改変への応用

连续多碱基随机取代方法的建立及其在磷脂酶D功能修饰中的应用

基本信息

批准号：
15760586
负责人：
岩崎雄吾
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15760586/
关键词：
PCR ランダム変異蛍光タンパク質ホスホリパーゼD 機能改変

项目摘要

連続複数塩基ランダム置換法(RARE-COMBI法)の検討クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子をモデル鋳型とし、3'末端近傍にミスマッチを有する合成DNAをプライマーとした相補鎖合成をPCR法で検討したところ、(1)DNAポリメラーゼは校正活性の低いものを用いる、(2)反応サイクル数を通常のPCRより長く(50サイクル)設定する、(3)25サイクル終了後にポリメラーゼを再添加する。という三つの条件を満足すれば、ミスマッチプライマーでも通常のプライマーと同様の増幅率が得られ、かつ意図したとおりの変異が導入できることを確認した。また、ミスマッチプライマーとミスマッチの無い完全アニール型プライマーを混合して競合的にPCRを行っても、そのプライマーの投入比の通りに変異DNAが出現することを確認した。次に、クラゲ緑色蛍光タンパク質(GFP)をターゲットとして、RARE-COMBI法により特定の制限酵素認識部位を導入するというモデル実験を行った。その結果、予想した通りの変異導入が原理的に可能であることを実証できた。しかしながら、変異導入効率は5%程度と低いため、更なる改良が必要である。ホスホリパーゼD(PLD)の機能改変RARE-COMBI法が未完成であったため、既存の方法によりPLD遺伝子のコンビナトリアルライブラリを構築した。また、人工リン脂質であるホスファチジルナフトール類を合成基質とした簡便なハイスループット検出法を確立した。この検出法を用いて野生型酵素では本来活性を示さない人工リン脂質であるホスファチジル-1-ナフトールに対してスクリーニングを行ったところ、それを分解する能力を獲得した変異型PLDを取得することに成功した。

连续多碱基随机取代法（RARE-COMBI法）的研究以氯霉素乙酰转移酶基因为模型模板，以3’末端附近存在错配的合成DNA为引物（1. ) 使用校对活性低的 DNA 聚合酶，(2) 设置比正常 PCR 更长的反应循环数（50 个循环），(3) 25 个循环后重新添加聚合酶。经证实，只要满足以下三个条件，错配引物就能达到与正常引物相同的扩增率，并引入预期的突变。另外，即使将错配的引物与没有错配的完全退火的引物混合来进行竞争性PCR，也确认了根据引物的投入比例而出现突变DNA。接下来，我们进行了模型实验，其中以水母绿色荧光蛋白（GFP）为目标，使用 RARE-COMBI 方法引入了特定的限制性酶识别位点。结果，我们能够证明预测的突变引入原则上是可能的。但突变导入效率低至5%左右，需要进一步改进。由于用于磷脂酶D（PLD）功能修饰的RARE-COMBI方法尚未完成，我们使用现有方法构建了PLD基因的组合文库。我们还建立了一种使用磷脂酰萘酚（人工磷脂）作为合成底物的简单高通量检测方法。利用这种检测方法，我们筛选了一种对野生型酶不表现出任何活性的人工磷脂——磷脂酰-1-萘酚，并成功找到了能够降解它的突变PLD。