Generation of silkworm lacking silk gland suitable for insect factories

适合昆虫工厂的缺乏丝腺的蚕的产生

基本信息

批准号：
21K19121
负责人：
日下部宜宏
金额：
$ 4.16万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は、無絹糸腺カイコ作製のためのマスター候補遺伝子ノックアウトカイコの内、胚性致死となった遺伝子を除く２遺伝子（KWMTBOMO06272とKWMTBOMO15340:BmSage）について、ノックアウトホモのG1世代を育成した。KWMTBOMO06272ノックアウトカイコについては、T7ヌクレアーゼ解析により変異アレルをホモに持つことを確認した全個体で正常な吐糸が観察されたため、同遺伝子をノックアウトしても無絹糸腺カイコにはならないことが明らかとなった。一方、BmSageについては、G0作製に用いたp50系統をバックグラウンドに持つ個体で、GFPをレポーター遺伝子としてウイルス感受性を調査したが、顕著なタンパク質発現の向上は認められなかった。そこで、タンパク質高生産性系統であるf38系統への導入を試み、T7ヌクレアーゼ解析により変異アレルを持つG0個体をf38と交配し、そのF2を観察したが、無絹糸腺カイコが分離しなかった、この交配を４区繰り返したが、やはり無絹糸腺カイコが分離しなかったため、p50系統においてホモ化し無絹糸腺カイコをf38と交配し、そのF2において分離した無絹糸腺カイコにレポーター遺伝子を発現する組換えウイルスを感染させたが、明瞭なタンパク質高発現は確認されていない。また、当初は、組換えタンパク質生産に絹糸腺や絹タンパク質は不必要であり、これらに消費されるエネルギーやタンパク質の原料となるアミノ酸を外来有組換えタンパク質生産に提供できれば、より効率のよいタンパク質生産が達成できると考えていたが、絹糸腺欠失カイコにおいても顕著な体重等の増加は認められず、外見からホモ個体を判別することはできなかった。また、絹糸腺で高発言しているLong non-coding RNAを対象としたゲノム編集のためのgRNAの設計を行い、in vitroでの切断効率を確認した。

今年，在生产无丝腺蚕的主候选基因敲除蚕中，我们对两个基因（KWMTBOMO06272和KWMTBOMO15340：BmSage）进行了G1代纯合敲除，排除了导致胚胎致死的基因。对于KWMTBOMO06272基因敲除家蚕，在T7核酸酶分析证实具有纯合突变等位基因的所有个体中均观察到正常吐丝，因此显然敲除该基因不会产生无丝丝腺家蚕。它变成了。另一方面，关于BmSage，使用GFP作为报告基因在具有用于G0生产的p50菌株背景的个体中研究病毒敏感性，但没有观察到蛋白质表达的显着改善。因此，我们尝试将其导入高蛋白生产品系f38品系中，通过T7核酸酶分析将具有突变等位基因的G0个体与f38进行杂交，观察到F2，但没有分离到无丝腺蚕。重复了四段，还是没有发现丝线。由于未分离出腺蚕，将p50品系中均质化的蚕与f38杂交，在F2时分离出的无丝腺蚕感染了表达报告基因的重组病毒，但未检测到明确的蛋白高表达。尚未得到证实。另外，丝腺和丝蛋白最初对于重组蛋白生产来说是不必要的，如果能够将这些腺体和作为蛋白原料的氨基酸所消耗的能量提供给外源重组蛋白生产，就可以更高效地生产蛋白。尽管人们认为可以实现生产，但在丝腺缺陷的蚕中没有观察到体重的显着增加，并且不可能从外观上区分纯合个体。此外，我们针对丝腺中高表达的长链非编码RNA设计了用于基因组编辑的gRNA，并在体外证实了其切割效率。