破骨細胞の小胞輸送に関与する新規遺伝子の同定とその機能

破骨细胞囊泡运输新基因的鉴定及其功能

基本信息

批准号：
16J03008
负责人：
山口優
金额：
$ 0.83万
依托单位：
Nagasaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2016
资助国家：
日本
起止时间：
2016-04-22 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16J03008/
关键词：
Rabタンパク質破骨細胞小胞輸送破骨細胞分化

项目摘要

１）Rab44結合タンパク質の同定一般的にRabタンパク質には多くのエフェクタータンパク質が結合して機能する。特に破骨細胞では、極性輸送を示すことから、新規のタンパク質と結合する可能性も十分考えられた。そこでRab44タンパク質に結合するタンパクを同定するために、まず内在性タンパク質について免疫沈降法を行った後、質量分析法を用いて相互作用する分子を同定した。幸い、2分子が同定できた。まだ発表段階ではないためここではその分子の名称は割愛する。なお、結合する可能性が示された分子は再度もう一方に分子の抗体を用いて免疫沈降法で確認している。２）Rab44遺伝子欠損マウスの作成本遺伝子の生体内での機能を探るべく遺伝子欠損マウスを作製し、解析を試みた。作製は既に理化学研究所生体ゲノム工学研究チームに協力を依頼し、CRISPR/Cas9による迅速な作製方法で実行している。受精卵に注入したsgRNA/Cas9 が標的遺伝子の片方もしくは両方のアレルを切断すると変異マウスが得られる。両アレルが破壊された場合には，欠損ホモマウスとなる。卵割したのちにCas9が標的配列を切断するとモザイクマウスが生まれるため区別できる。ホモマウスが誕生したので解析してみるとRab44の発現レベルは若干ではあるが検出できた。詳細な理由は不明であるが、遺伝子の欠失が不完全であったようである。そこでもう一度、全Rab44遺伝子を欠失できるように欠失領域を再設計して、マウスを再作製した。現在はそのヘテロマウスが誕生して、今後はヘテロ同士で交配させる予定である。

1) Rab44结合蛋白的鉴定一般来说，Rab蛋白通过与许多效应蛋白结合而发挥作用。特别是，破骨细胞表现出极性运输，因此它们很可能与新蛋白质结合。因此，为了鉴定与 Rab44 蛋白结合的蛋白，我们首先对内源蛋白进行免疫沉淀，然后使用质谱法来鉴定相互作用的分子。幸运的是，鉴定出了两种分子。由于尚未处于公布阶段，因此此处省略该分子的名称。此外，已显示具有结合可能性的分子通过使用针对其他分子的抗体的免疫沉淀再次得到确认。 2）Rab44基因缺陷小鼠的创建为了探索该基因在体内的功能，我们创建了基因缺陷小鼠并尝试对其进行分析。在RIKEN生物基因组工学研究小组的合作下，已通过使用CRISPR/Cas9的快速生产方法进行了生产。当 sgRNA/Cas9 注射到受精卵中并裂解目标基因的一个或两个等位基因时，就获得了突变小鼠。如果两个等位基因都被破坏，则小鼠成为无效纯合小鼠。卵子裂解后，Cas9 裂解目标序列，产生可区分的嵌合小鼠。当纯合子小鼠出生时，我们对它们进行了分析，并能够检测到 Rab44 的表达水平，尽管水平很小。虽然详细原因尚不清楚，但看来基因删除并不完全。他们再次重新设计了删除的区域，从而可以删除整个 Rab44 基因并重新创建小鼠。目前，杂合子小鼠已经诞生，未来计划培育杂合子小鼠。

项目成果

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Rab44, a novel large Rab GTPase, negatively regulates osteoclast differentiation by modulating intracellular calcium levels followed by NFATc1 activation.

Rab44 是一种新型大型 Rab GTP 酶，通过调节细胞内钙水平和随后激活 NFATc1 来负向调节破骨细胞分化。

DOI：
10.1007/s00018-017-2607-9
发表时间：
2018
期刊：
影响因子：
0
作者：
Yu Yamaguchi; Eiko Sakai; Kuniaki Okamoto; Hiroshi Kajiya; Koji Okabe; Mariko Naito; Tomoko Kadowaki;Tsukuba T
通讯作者：
Tsukuba T

Actin binding LIM 1 (abLIM1) negatively controls osteoclastogenesis by regulating cell migration and fusion

肌动蛋白结合 LIM 1 (abLIM1) 通过调节细胞迁移和融合负向控制破骨细胞生成