重金属酵素・ニトリルヒドラターゼおよび重金属トランスポーターの構造機能解析

重金属酶、腈水合酶和重金属转运蛋白的结构和功能分析

• 批准号: 10129212
• 负责人: 清水 昌
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10129212/
• 关键词: コバルト; ニトリルヒドラターゼ; トランスポーター; ニトリル; アシド

鉄型二トリルヒドラターゼ(NHase)のX線結晶構造解析から、鉄のリガンドであることが判明している3つのシステイン残基に相当する(Rhodococcus rhodochrousJlの)コバルト型NHaseのαサブユニットにおける107Cys,105Cys,102Cysの機能を解析した。すなわち、これら3つのシステイン残基をアラニンに部位特異的変異法により置換することで、合計7種類の変異酵素(107,105,102,107/105,105/102,107/102,107/105/102)に対応する各遺伝子を作製した後、宿主Rhodococcus rhodochrous ATCC12674に形質転換し、発現させた。これらの変異酵素は無細胞抽出液レべルで全てNHase活性を示さなかった。SDS-PAGEによる検討の結果、4種(107,105,107/105,105/102)はNHase変異酵素を発現し、残り3種(102,107/102,107/105/102)は対応するNHaseタンパク質を産生しなかった。107,105,107/105,105/102の4種類のNHase変異酵素の性質を解析すべく、精製を試みた。無細胞抽出液の調製、硫安分画に続き、DEAE-Sephacel、Superdex200、Phenyl-SepharoseCL-4B、Mono-Qにより均一な各変異酵素標品を得、諸性質を検討した結果、いずれの変異酵素においても、野生型のH-NHaseでみられるコバルトに由来すると考えられる420nmの吸収極大はほとんど認められなかった。2アミノ酸置換の実験結果から、102Cysあるいはl07Cysのどちらかが存在すればNHaseタンパク質が生成すると言えるのに対し、1アミノ酸置換の実験結果からは、102CysがNHaseタンパク質生成に重要な残基であることが示唆された。これらの結果から、いずれのシステイン残基もNHase活性発現にとって重要であることが判明した。さらに、NHaseの反応機構として2種類のモデルを提唱した。すなわち、OH^-(あるいは金属に結合した水分子)に基質であるニトリルが接近し、続いて、OH^-(あるいはOH^-の塩基としての作用によって活性化された水分子)がニトリルの炭素原子を求核攻撃しイミド酸を生成し、最終的にアミドに変換される。

铁型丁二酚水解酶（NHASE）的X射线晶体学分析分析了钴型NHase（Rhodococcus rhodochrousjl）α亚基中107个Cys，105个Cys和102个CYS的功能，这些功能对应于与三个Cysteene to Sesteine to Sytesteine to cysteesine to Sytesteine to cysteconine to cystechine。 That is, by replacing these three cysteine ​​residues with alanine by a site-directed mutation method, each gene corresponding to a total of seven mutant enzymes (107, 105, 102, 107/105, 105/102, 107/105/102), was produced, and then transformed into the host Rhodococcus rhodochrous ATCC12674 and expressed.所有这些突变酶在无细胞提取物水平上没有NHASE活性。通过使用SDS-PAGE进行研究的结果，四种（107、105、107/105、105/102）表达了NHase突变酶，而其余三种（102、107/102、107/105/102）没有产生相应的NHase蛋白质。纯化试图分析四种类型的NHase突变酶的特性：107、105、107/105和105/102。在制备无细胞提取物和硫酸铵分馏之后，使用DEAE-Sephacel，SuperDex200，苯基 - 丝状sepharosecl-4b和Mono-Q获得了均相突变酶制剂，并检查了这些特性。结果，对于任何一种突变酶，几乎没有观察到最大的420 nm吸收，被认为是源自野生型H-NHASE中的钴的吸收。两种氨基酸取代的实验结果表明，当存在102CY或L07CYS时，会产生NHASE蛋白，而一种氨基酸取代的实验结果表明102Cys是NHASE蛋白质产生的重要残基。这些结果表明，两个半胱氨酸残基对于NHASE活性表达都很重要。此外，已经提出了两种类型的模型作为NHASE的反应机制。也就是说，底物氮接近OH^ - （或与金属结合的水分子），然后OH^ - （或通过OH^ - 作为基部的作用而激活的水分子）亲核攻击氮原子的碳原子以产生咪二酸，以最终转化为酰胺。

项目成果

Kobayashi,M.et al.: "Nitrilase catalyzes amide hydrolysis as well as nitrile hydrolysis" Biochem.Biophys.Res.Commun.253. 662-666 (1998)

Kobayashi,M.et al.：“腈水解酶催化酰胺水解以及腈水解”Biochem.Biophys.Res.Commun.253。

Kobayashi,M.et al.: "The catalytic mechanism of amidase also involves nitrile hydrolysis" FEBS Lett.439. 325-328 (1998)

Kobayashi,M.et al.：“酰胺酶的催化机制还涉及腈水解”FEBS Lett.439。