Does phase-separation of DNA double-strand break repair factors promote chromosome rearrangement?

DNA双链断裂修复因子的相分离是否促进染色体重排？

• 批准号: 22K12376
• 负责人: 山内 基弘
• 金额: $ 2.66万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K12376/
• 关键词: DNA二本鎖切断; DNA修復; 染色体再編成; 相分離

本研究の目的は、53BP1やその他のDNA二本鎖切断（DSB）修復因子の相分離と染色体再編成の関係を明らかにすることである。2022年度は、オンラインプログラムで天然変性領域を持つことが予測されたDSB修復関連因子が、細胞内のDSB部位で相分離するかどうかを調べた。DSB修復関連因子のDSB部位における集積は、正常ヒト網膜上皮細胞RPE-hTERT細胞にγ線を照射後固定して、それぞれのDSB修復関連因子に対する抗体を用いた蛍光免疫染色を行い、蛍光顕微鏡下で斑点状の「フォーカス」として可視化した。相分離阻害剤としては、1,6-ヘキサンジオールや酢酸アンモニウム、スクロースを用い、γ線照射30分前から固定時まで細胞に処理した。この実験の結果、DSB修復関連因子のうち、CtIP、BRCA1、RAD51AP1タンパク質が相分離阻害剤処理時にDSB部位にフォーカスを形成しなくなることがわかった。この結果はこれらのタンパク質のDSB部位への集積に相分離が必要であることを示唆する。さらにCtIPについては、GFP融合タンパク質を発現するベクターを作製して細胞に導入したところ、GFP-CtIPは相分離するタンパク質の特徴である、液滴形成を示した。この結果はCtIPタンパク質が相分離していることを示している。また53BP1に関しては、相分離に必要な領域を欠失した「相分離不能変異体」の発現ベクターを作製中である。

本研究的目的是阐明53BP1的相分离与其他DNA双链断裂（DSB）修复因子和染色体重排之间的关系。在 2022 财年，我们研究了通过在线程序预测具有自然变性区域的 DSB 修复相关因子是否在细胞内的 DSB 位点发生相分离。通过用伽马射线照射正常人视网膜上皮细胞RPE-hTERT细胞并固定它们，并使用针对各DSB修复相关因子的抗体进行免疫荧光染色，确定DSB位点处的DSB修复相关因子的积累，并将其可视化。斑点“焦点”。使用1,6-己二醇、乙酸铵和蔗糖作为相分离抑制剂，从γ射线照射前30分钟直至固定时处理细胞。本实验的结果发现，在DSB修复相关因子中，CtIP、BRCA1和RAD51AP1蛋白在用相分离抑制剂处理后不再在DSB位点形成焦点。这一结果表明这些蛋白质在 DSB 位点的积累需要相分离。此外，关于CtIP，当创建表达GFP融合蛋白的载体并将其引入细胞中时，GFP-CtIP显示出液滴形成，这是经历相分离的蛋白质的特征。该结果表明CtIP蛋白是相分离的。关于53BP1，我们目前正在为“相分离突变体”创建一个表达载体，该突变体缺乏相分离所需的区域。