COEベクターを用いたX線照射ヒト初代培養細胞におけるP53蓄積機構の解明

使用 COE 载体阐明 X 射线照射的人原代培养细胞中 P53 积累机制

基本信息

批准号：
03J50821
负责人：
山内基弘
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Nagasaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J50821/
关键词：
COEベクター p53 リン酸化蓄積アラニン置換ヒト初代培養細胞

项目摘要

昨年度はCOEベクターがゲノムに組み込まれる際に生じるDNA二重鎖切断にヒト初代培養細胞が反応したことによるものと思われる、早期細胞老化が誘導されたため、本年度はクローン単離はせず、ベクター導入後すぐに選択培地中で培養することで実験に用いるまでの分裂回数を減らす工夫をした。それにもかかわらず、X線照射後のリン酸化部位アラニン置換型p53蛋白質のレベルを見るウエスタンブロットを行うのに十分な細胞数まで増殖する細胞は得られなかった。上記の実験と並行して、ヒト初代培養細胞がベクター導入時に生じると思われる、ごく少数のDNA二重鎖切断でなぜ増殖が抑制されるのかを調べた。この際、DNA二重鎖切断に伴うクロマチン構造変化を認識し、その部位にフォーカスを形成するSer1981リン酸化ATM蛋白質に着目した。本研究で用いているヒト初代培養細胞に低線量のX線照射後、リン酸化ATM蛋白質のフォーカスを経時的に観察した結果、最初に形成されたフォーカスの数は、DNA二重鎖切断修復に伴い経時的に減少したが、長時間残存するフォーカスは明らかに大きくなっていることが分かった。このフォーカスのサイズ増大と増殖抑制のシグナル増幅の関係を明らかとするため、リン酸化ATMフォーカスの直径とSer15リン酸化p53蛋白質の蓄積の関係を調べた結果、フォーカスサイズに比例してリン酸化p53陽性細胞の割合が増加することが分かった。さらに大きなリン酸化ATMフォーカスを持つG1期細胞は永久的にS期に進行できないことも明らかとなった。この結果から、ベクターが導入されたゲノム領域はDNA二重鎖切断再結合後もクロマチンの高次構造が回復しておらず、その部位に大きなリン酸化ATMフォーカスが形成されることによって、その細胞の増殖が抑制されることが示唆された(論文準備中)。

去年，由于将COE载体纳入了基因组，因此人们认为第一个代代的培养细胞对DNA双链切割做出了反应，因此诱导了早期的细胞衰老，因此载体今年没有立即分离克隆引入后，将其培养在选择培养基中，以减少分裂的数量，直到用于实验。然而，没有细胞增殖的细胞增殖到足够的细胞以观察X射线照射后磷酸化p53蛋白p53蛋白的水平。与上述实验并行，我们研究了为什么当引入载体时可能发生第一个代代培养细胞时，很少数量的DNA双链切割会被抑制。目前，它识别出与DNA双链断开相关的染色质结构的变化，重点是Ser1981磷酸磷酸化的ATM蛋白，该磷酸化ATM蛋白构成了该部位的重点。在本研究中使用的第一个人类培养细胞中低剂量x-射线照射后，磷酸化的ATM蛋白的焦点随着时间的流逝，首先形成的焦点的数量是DNA双链切割的焦点。随着时间的流逝，但长期以来持续很长时间。由于检查了ATM磷酸化AMT直径与Ser15磷酸盐p53蛋白的积累之间的关系，以阐明大小增加与增殖抑制之间的关系，以及Ser15磷酸盐的积累以阐明焦点大小增加与抑制增殖之间的关系，焦点的积累与焦点大小p53阳性p53阳性p53阳性p53阳性p53阳性p53成正比。同样很明显，具有较大磷酸化ATM焦点的G1细胞在S期间无法永久进行。结果，引入载体的基因组区域没有恢复DNA双链切割后染色质的较高顺序结构，并且细胞是由该区域中大型磷酸盐形成的。被抑制（准备论文）。

项目成果

期刊论文数量（4）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

放射線照射後残存するDNA損傷チェックポイント因子のフォーカスの生物学的意義

关注放射线照射后残留的DNA损伤检查点因子的生物学意义

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
放射線生物研究 40(3)
影响因子：
0
作者：
山内基弘;山内基弘;山内基弘
通讯作者：
山内基弘

The role or phosphorylation in IR-induced p53 stabilization and activation

磷酸化在 IR 诱导的 p53 稳定和激活中的作用

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
Acta Medica Nagasakiensia 50
影响因子：
0
作者：
山内基弘
通讯作者：
山内基弘

Stabilization of alanine substituted p53 at Ser15, Thr18, and Ser20 in response to ionizing radiation

丙氨酸取代 p53 Ser15、Thr18 和 Ser20 响应电离辐射的稳定性

DOI：
发表时间：
2004
期刊：
Biochemical and Biophysical Research Communications 323
影响因子：
0
作者：
山内基弘;鈴木啓司;児玉靖司;渡邉正己
通讯作者：
渡邉正己

DOI：
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柴田淳史