Investigation of ligands against an unique receptor expressing in avian oocytes and its physiological function

针对禽类卵母细胞中表达的独特受体的配体及其生理功能的研究

基本信息

批准号：
22K19244
负责人：
村井篤嗣
金额：
$ 4.08万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19244/
关键词：
畜産学生理学ニワトリ卵栄養素脂質栄養

项目摘要

・産卵期のニワトリの卵母細胞膜で「低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質２ライク（LRP2L）」と仮称される機能未知の遺伝子が発現することを見つけ出した。本研究では、この受容体の生体内リガンドを同定することを目的とする。・ニワトリの卵母細胞に由来するcDNAを鋳型として、膜貫通領域を除いたLRP2L（翻訳開始点から31-2,120アミノ酸残基をコード）の遺伝子断片をPCRで増幅した。増幅した遺伝子断片は哺乳類細胞用発現ベクターに連結し、分泌型LRP2L発現ベクターを構築した。・哺乳類細胞を用いて、分泌型LRP2Lを培地中に放出させて、その培地からLRP2Lを精製した。その結果、分子サイズ約300 kDa前後に明瞭な単一のバンドが検出された。以上から、分泌型LRP2Lは予想通りのサイズで作出できたと判断した。・作出した分泌型LRP2Lをウサギに免疫し、リガンド結合部位に対する特異抗体を作出した。この抗体は、LRP2Lと特異的に結合することを確認した。今後、この抗体を利用してLRP2L受容体と候補リガンドとの結合を阻害することが出来るかを調査する。・作出したLRP2Lは予定通りのサイズで産生されるものの、分子サイズが巨大であるため、産生量が少ないことが判明した。そこで、分泌型LRP2L発現ベクターを鋳型として、4つの異なる分子サイズの分泌型ミニLRP2Lを作出した。そのうちの1つは培地への分泌量が高く、大量精製が可能となった。一連の成果により、LRP2Lのリガンド探索に活用できる組換えタンパク質を得ることができた。

・我们发现了一种功能未知的基因，暂时命名为“低密度脂蛋白受体相关蛋白2样”（LRP2L），在产蛋期鸡的卵母细胞膜中表达。本研究的目的是鉴定该受体的体内配体。・以鸡卵母细胞来源的cDNA为模板，通过PCR扩增除跨膜区域以外的LRP2L基因片段（编码从翻译起始点起的第31-2,120位氨基酸残基）。将扩增的基因片段与哺乳动物细胞表达载体连接，构建分泌型LRP2L表达载体。・使用哺乳动物细胞，将分泌的LRP2L释放到培养基中，并从培养基中纯化LRP2L。结果，检测到分子大小约为 300 kDa 的清晰单条带。基于上述，得出结论，可以产生具有预期大小的分泌型LRP2L。・我们用产生的分泌型LRP2L对兔子进行免疫，并产生了针对配体结合位点的特异性抗体。该抗体被证实与 LRP2L 特异性结合。未来我们将研究该抗体是否可以用于抑制LRP2L受体与候选配体之间的结合。・虽然制作出的LRP2L达到了预期的尺寸，但由于分子尺寸较大，因此产量较少。因此，我们使用分泌型LRP2L表达载体作为模板，创建了具有四种不同分子大小的分泌型迷你LRP2L。其中一种在培养基中的分泌量很高，因此可以大量纯化。通过一系列的结果，我们获得了可用于寻找LRP2L配体的重组蛋白。