piRNA and spermatogenesis on reproductive isolation

piRNA 和精子发生对生殖隔离的影响

基本信息

批准号：
22K19236
负责人：
杉山文博
金额：
$ 4.16万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-06-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K19236/
关键词：
ゲノム編集 small RNA piRNA microRNA 精子形成生殖隔離マウス

项目摘要

本研究は、雑種不稔マウスモデルを用い、連続する精子形成でのpiRNAを含む転写物のダイナミクスな発現様式をゲノムワイドに明らかにし、生殖隔離における雄性減数分裂停止機構の解明に挑戦することを目的としている。2022年度は、①候補piRNA群をランダムもしくは網羅的に破壊することが可能なsgRNAベクターライブラリの開発と②生殖細胞のみで蛍光タンパクEGFPとゲノム編集エフェクターの両者を発現するマウスの開発、を実施した。①候補piRNA群をランダムもしくは網羅的に破壊することが可能なsgRNAベクターライブラリの開発では各候補piRNAにそれぞれ対応した17種類のsgRNA発現ベクターを構築した。これらのベクターにはpiRNAに対応するsgRNAだけではなく、切断することで蛍光タンパクが発現する切断レポーターカセットも搭載した。実際に生殖細胞でゲノム編集を生じさせる前に、各sgRNAの切断活性をマウス胚性幹細胞で評価した。切断をレポートする蛍光を発現する細胞のみを分取して、それらをシングルセルクローニングし、ゲノムDNAを抽出した。それらをクローンにおける変異をPCRもしくはサンガーシークエンスで確認したところ、sgRNA間で活性に差があったものの全てのsgRNAが標的サイトに変異誘導が可能であった。②生殖細胞のみで蛍光タンパクEGFPとゲノム編集エフェクターの両者を発現するマウスの開発では、生殖細胞特異的に発現することが知られているマウス内在性遺伝子の下流に、IRESでつないだEGFP遺伝子とゲノム編集エフェクター遺伝子を受精卵ゲノム編集でノックインした。ノックインが確認されたファウンダーマウスにおいて、生殖細胞でEGFPが発現することが確認できた。

本研究利用杂交不育小鼠模型，以全基因组的方式阐明持续精子发生过程中包括piRNA在内的转录物的动态表达模式，旨在阐明生殖隔离中雄性减数分裂停滞的机制。 2022财年，我们进行了以下工作：（1）开发可随机或全面破坏候选piRNA组的sgRNA载体库；（2）开发仅在生殖细胞中表达荧光蛋白EGFP和基因组编辑效应子的小鼠. ① 为了开发能够随机或全面破坏候选piRNA组的sgRNA载体库，我们构建了与每个候选piRNA对应的17种sgRNA表达载体。这些载体不仅装载了与 piRNA 相对应的 sgRNA，还装载了可切割以表达荧光蛋白的切割报告盒。在生殖细胞中实际进行基因组编辑之前，在小鼠胚胎干细胞中评估了每种 sgRNA 的切割活性。仅筛选出表达裂解的荧光的细胞，进行单细胞克隆并提取基因组 DNA。当通过 PCR 或桑格测序证实这些克隆中的突变时，所有 sgRNA 都能够在其靶位点诱导突变，尽管 sgRNA 之间的活性存在差异。 ② 在仅在生殖细胞中表达荧光蛋白EGFP和基因组编辑效应子的小鼠的发育过程中，与IRES连接的EGFP基因被放置在已知在生殖细胞中特异性表达的小鼠内源基因的下游。通过受精卵基因组编辑敲入效应基因。在确认敲入的创始小鼠中，EGFP被证实在生殖细胞中表达。