カイコ小胞体ストレス応答の理解に基づくタンパク質発現システムの合理的デザイン

基于家蚕内质网应激反应合理设计蛋白表达系统

基本信息

批准号：
22KJ2484
负责人：
海老原健
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2023
资助国家：
日本
起止时间：
2023-03-08 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

本研究の目的は、カイコ小胞体ストレス応答の理解によるタンパク質分泌不全の原因解明と、その克服による大量生産システムの確立である。そのために、NGS解析を用いた分泌不全時に特異的に発現変動する小胞体ストレス応答関連遺伝子の抽出および分泌不全原因の候補遺伝子の選抜を実施した。まず、カイコ小胞体ストレス応答遺伝子群の同定と高分泌性および低分泌性の組換えタンパク質モデルの選定を行った。カイコ培養細胞をN型糖鎖修飾阻害剤であるツニカマイシンで処理し、RNA-seq解析を用いた発現変動遺伝子群の抽出を行った。結果として、小胞体ストレス応答誘導時に発現が上昇するカイコ小胞体ストレス応答遺伝子の同定に成功した。モデルタンパク質の選定に関しては、低分泌性タンパク質発現時に特異的な発現変動遺伝子を抽出するために、発現させるタンパク質そのものの影響が可能な限り排除されることを指標とした。その結果、アミノ酸配列やAlphaFold2で予測された立体構造の類似性が高い、ヒトとマウス由来のInterleukin-1α (IL-1α) の分泌量に大きな差があり、モデルタンパク質として優れていると考えた。また、これらのヒトとマウスIL-1αのドメイン置換により、分泌量が段階的に異なる複数のキメラIL-1αの作製にも成功した。次に、分泌性の異なるIL-1αをカイコ培養細胞で発現させ、遺伝子発現データの取得および発現変動遺伝子の抽出を行った。組換えタンパク質の発現が始まるウイルス感染24時間後で比較を行ったが、低分泌性組換えタンパク質発現時特異的に発現変動する遺伝子は2つのみで、いずれも小胞体ストレス応答遺伝子ではなかった。また、組換えバキュロウイルス感染時と非感染時の解析では、組換えタンパク質の過剰発現状態であるにも関わらず、小胞体ストレス応答遺伝子の発現上昇が一部抑制されていることが示唆された。

这项研究的目的是通过了解蚕内质网应激反应来了解蛋白质分泌失败的原因，并通过克服它来建立质量生产系统。为此，我们提取了与内质网应激反应有关的基因，这些基因使用NGS分析在分泌失败期间特异性表达，并选择了分泌失败原因的候选基因。首先，我们确定了一组用于蚕的基因应力反应，并选择了高度分泌和低分泌的重组蛋白。培养的蚕细胞用衣霉素（N型聚糖修饰的抑制剂）处理，并使用RNA-SEQ分析提取表达的基因组。结果，我们成功地鉴定了蚕肾应力反应基因，当由内质网应激反应诱导时，其表达会增加。关于模型蛋白的选择，指标是将要表达的蛋白质本身的作用被排除在外，以便在低分泌蛋白表达时提取特定的表达变量基因。结果，来自人类和小鼠的白介素-1α（IL-1α）的分泌量差异很大，在氨基酸序列中具有很高的相似性以及Alphafold2预测的三维结构，使其成为极好的模型蛋白。此外，通过取代这些人和鼠IL-1α结构域，我们成功地产生了多个嵌合IL-1α，它们在阶段中具有不同的分泌水平。接下来，在培养的蚕细胞中表达具有不同分泌特性的IL-1α，并获得基因表达数据并提取基因变异。在表达重组蛋白时，在病毒感染后24小时进行了比较，但在表达低凝性重组蛋白时只有两个基因被特异性表达，并且都不是内质重组的基因。此外，重组杆状病毒感染和未感染的分析表明，尽管重组蛋白过度表达，但内质网应激反应基因的表达升高仍被部分抑制。