放線菌を利用した光誘導型タンパク質大量生産系の創生

利用放线菌创建光诱导蛋白质大规模生产系统

基本信息

批准号：
22H02248
负责人：
高野英晃
金额：
$ 11.32万
依托单位：
Nihon University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02248/
关键词：
光センサータンパク質生産放線菌組換えタンパク質生産ファージRNAポリメラーゼ組換えタンパク質

光センサータンパク質生産放線菌組換えタンパク質生産ファージRNAポリメラーゼ組換えタンパク質

项目摘要

放線菌Streptomyces griseusをホストとして、ビタミンB12型光センサーLitRを応用した組換えタンパク質の光誘導型大量生産系プロトタイプの構築に成功し、LiEX(Light inducible Expression)システムと命名した。1. プラスミド型LiEXシステム(pLiEX)放線菌由来のpIJ101型マルチコピープラスミドにLitRとσ因子LitSを導入したプラスミドpLit19を構築し、レポーター酵素β-グルクロニダーゼ(GUS)活性を指標として機能を評価したところ、光照射時においてのみ極めて高いGUS活性が確認された。細胞内における発現量を解析したところ、細胞内で最も生産量の高いタンパク質として検出されたことから、光誘導型プラスミドの構築に成功した。また、ホストの検討を行ったが、S. griseusで非常によく機能する一方で、S. lividansなどの他の放線菌では機能しなかったが、その理由は不明である。2. ゲノム組込み型LiEXシステム(iLiEX)光スイッチLitRSとT7RNAポリメラーゼを連結してゲノム上に組み込んだところ、光スイッチLitRS単独の場合と比較して、転写レベルを500～1000倍に増幅できることを見出した。これはT7RNAポリメラーゼが効率よくT7プロモーターからの転写を行ったことが原因と考えられる。上記のプラスミド型と異なって、ゲノム上に組み込むため、ゲノム上における高い保持性、シングルコピーのためコピー数効果による二次的効果の可能性排除など複数の利点を有している。また、ファージインテグラーゼを用いたゲノム組込みベクターは、大腸菌からの接合伝達によって極めて高効率・簡便にDNAを導入できる。

我们使用维生素B12型光传感器LITR成功地构建了重组蛋白的光诱导的重组蛋白的质量产生原型，并将其命名为LIEX（光诱导表达）系统。 1。质粒plit19构建了源自放线菌的PIJ101多拷贝质粒中的LITR和σ因子LIT，并构建了该功能，并使用报告酶β-β-葡萄糖蛋白酶（GUS）活性作为指数，并且仅在光度下进行了极高的确认。当分析细胞中的表达水平时，将其检测为细胞中产生量最高的蛋白质，因此构造光诱导的质粒是成功的。我们还研究了宿主，尽管它与S. griseus效果很好，但它与其他放线菌（如S. lividans）没有使用，但其原因却未知。 2。当基因组集成的LIEX系统（ILIEX）Photoswitch Litrs和T7RNA聚合酶连接并整合到基因组上时，发现与单独的Photoswitch Litr相比，转录水平可以扩增500-1000次。这被认为是由T7启动子的T7 RNA聚合酶的有效转录引起的。与上述质粒类型不同，它已掺入基因组中，并且具有多个优点，例如在基因组中的高保留率，以及由于单个副本而导致的副本效应而消除了次级效应的可能性。此外，使用噬菌体积分酶的基因组整合向量可以通过大肠杆菌的共轭传播以极其有效且方便的方式引入DNA。