昆虫工場における組換えタンパク質生産性改善のための新規指向性進化法の開発

开发一种新的定向进化方法以提高昆虫工厂重组蛋白的生产力

• 批准号: 22K20581
• 负责人: 増田 亮津
• 金额: $ 1.83万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-08-31 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K20581/
• 关键词: バキュロウイルス; カイコ; 指向性進化; タンパク質工学

本研究は、カイコに感染するバキュロウイルスに、昆虫生体内において目的遺伝子の変異導入と優良変異体の効率的な選抜という指向性進化のサイクルを実行させ、カイコ-バキュロウイルス発現系における組換えタンパク質の生産性改善を分子進化によって可能にすることを目的とする。そのために、(1)昆虫細胞内で特定のDNA領域内にランダムな変異を導入する技術の確立と、(2)優良な変異体が効率的に選抜されるような技術を開発し、これらの技術を統合して、(3)カイコで少量しか作れない難発現性の組換えタンパク質の指向性進化による生産性改善を目指す。本年度は、(1)のランダム変異導入において、変異導入酵素融合T7RNAポリメラーゼを発現する組換えバキュロウイルスを作製し、実際にT7プロモータ直下の領域に変異導入可能かどうかを調べた。組換えウイルスをカイコに感染させることで目的の酵素自体の大量発現は認められた。一方で、カイコ内で増殖したウイルス粒子からゲノムを抽出し、次世代シークエンサーで解析したが、顕著な変異を検出することができなかった。(2)では、優良変異体が自動選抜されるようなシステムに利用するため、まずはノックアウトするとバキュロウイルスの効率的な増殖に影響がある遺伝子8種類をそれぞれバキュロウイルスのゲノムから削除し、次にそれぞれの遺伝子をレスキューしたときにウイルスの増殖性が回復するかを調べている。各遺伝子のKOウイルス作製には大腸菌内でのRed組換えを使用しており、初期に遺伝子欠損ゲノムを得ることがなかなかうまくいかなかったが、系を見直すことで遺伝子欠損ゲノムが得られるようになったため、現在、遺伝子欠損ウイルスを順次作製している最中である。

这项研究的目的是使感染蚕的杆状病毒能够执行靶基因的诱变的定向进化循环，并有效地选择了昆虫体内上的卓越突变体，从而使分子进化可以提高蚕核病毒表达系统中重组蛋白的生产力。为此，我们旨在（1）建立一种技术，以在昆虫细胞内的特定DNA区域内引入随机突变，（2）开发可有效选择高质量突变体的技术，（3）旨在通过在小量粒度中生产的难以表达的重组蛋白的难以表达的重组蛋白来提高生产率。在（1）中的随机诱变中，产生了表达诱变酶融合T7RNA聚合酶的重组杆菌病毒，我们研究了是否实际上可以将诱变引入T7启动子下方的区域。通过用重组病毒感染蚕，观察到靶酶本身的大表达。另一方面，从蚕中生长的病毒颗粒中提取基因组，并使用下一代序列仪进行分析，但无法检测到明显的突变。在（2）中，为了使用该系统自动选择高质量的突变体，首先首先从杆状病毒基因组中删除了杆状病毒有效增殖的八种类型的基因，然后检查病毒的增殖特性是否将在每个基因被救出时恢复。大肠杆菌中的红色重组用于为每个基因创建KO病毒，并且很难在早期阶段获得缺乏基因的基因组，但是通过回顾系统，可以获得基因缺陷的基因组，因此我们目前正在基因缺乏型病毒的顺序产生。