Brain hypothermia focusing on erythropoietin and microglial activation control

脑低温关注促红细胞生成素和小胶质细胞激活控制

• 批准号: 22K09168
• 负责人: 田村 哲也
• 金额: $ 2.25万
• 依托单位: Nagoya City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K09168/
• 关键词: ミクログリア; 低体温療法; 蘇生後脳症; エリスロポエチン; エリスロポエチン受容体; 脳低温療法; 脳保護

蘇生後脳症モデルラットの作製を行なった。Rice vannucchi法に従い、生後7日齢ラット左総頚動脈結紮の後に低酸素負荷を加えることで一側性に脳傷害を誘導できた。モデルラットに実験的低体温療法を施した後、フローサイトメトリー（FACS）を用いたミクログリアの分取を試みたが、FACSの過程でミクログリアを含む神経系細胞の生存率が大幅に減少し、十分な細胞数を分取することができなかった。そこで、immunopanning法による分取を行なった。immunopanning法は細胞表面マーカー抗体で標識した後、2次抗体をコーティングしたペトリディッシュに播種することで分取する方法である。分取したミクログリアについて、細胞種特異的遺伝子の発現解析により特異的な分取に成功したことを確認した。遺伝子発現解析の結果、傷害性因子であるiNOSや炎症性サイトカインの発現が強く誘導されていた。さらに、低体温療法群ではこれらの傷害性因子の発現誘導が抑制された。一方で、抗炎症性サイトカインの発現は低体温療法により誘導された。これらの遺伝子変化は脳組織をバルクで解析した際には検出できなかったものであり、ミクログリアを分取して解析することに大きな意義があった。EPORの遺伝子発現解析の結果、モデルラット由来のミクログリアではEPOR発現が減弱し低体温療法により発現が回復する傾向がみられた。よって、低体温療法とEPO投与を併用することで脳保護効果を増強できる可能性が考えられた。初代培養ミクログリアに虚血再灌流モデル刺激を加えてEPORの発現解析を行なった。同様にEPOR発現減少傾向がみられたが、モデルラットの結果と比較すると変化は小さく、EPORの発現減少には虚血再灌流がミクログリアに直接与える影響と、ミクログリア以外の細胞から放出される液性因子の両方が関与している可能性が示唆された。

制备了带有震荡后脑病的模型大鼠。根据水稻vannucchi方法，在7天大的大鼠中左颈动脉结扎后，施加了低氧载荷，该大鼠单方面造成脑损伤。在实验性低温治疗以模型大鼠进行后，我们尝试使用流式细胞仪（FACS）分离小胶质细胞，但是在FACS过程中，包括小胶质细胞在内的神经系统细胞的存活率大大降低，并且没有足够的细胞计数。因此，使用免疫方法进行制剂。免疫剂量方法涉及用细胞表面标记抗体标记，然后将其播种在涂有二抗的培养皿中以制备它。通过分析细胞类型特异性基因，已确认所获得的小胶质细胞已成功地进行了特定的制剂。基因表达分析表明，iNOS的表达强烈诱导，即损伤因素和炎症细胞因子。此外，体温过低组抑制了这些伤害因素的诱导。另一方面，低温诱导抗炎细胞因子的表达。当大量分析脑组织时，未检测到这些遗传变化，并且在小胶质细胞的分析中具有很大的意义。由于基因表达EPOR的基因表达分析，EPOR表达倾向于从模型大鼠的小胶质细胞中减弱，并且使用体温过低来恢复表达。因此，认为体温过低和EPO给药的结合可以增强脑部保护作用。通过通过缺血再灌注模型刺激原发性培养的小胶质细胞来进行EPOR表达分析。类似地，与模型大鼠的结果相比，这种变化趋于降低EPOR表达，但表明缺血 - 重灌注对小胶质细胞的直接作用以及来自小胶质细胞以外的细胞中释放的体液因子的直接作用参与EPOR表达的降低。

项目成果

Hypothermic culture enhances secretion of astrocyte-derived neuroprotective erythropoietin.

低温培养可增强星形胶质细胞衍生的神经保护性促红细胞生成素的分泌。

• 发表时间: 2022
• 作者: 鳥内皐暉;垣田博樹;青木啓将;田村哲也;竹下覚;山田恭聖;青山峰芳
• 通讯作者: 青山峰芳

心停止蘇生後脳症に対する体温管理療法の脳保護作用機序の検討～低温培養がミクログリアの活性化へ及ぼす影響～

心脏骤停复苏后脑病温度管理疗法的脑保护机制探讨~低温培养对小胶质细胞活化的影响~

• 发表时间: 2022
• 作者: 田村哲也;太田晴子;志田恭子;藤掛数馬;加古英介;祖父江和哉
• 通讯作者: 祖父江和哉