カベオラ介在性アルブミンエンドサイトーシス阻害による普遍的なCKD治療薬の探索

通过抑制小窝介导的白蛋白内吞作用寻找通用的 CKD 治疗方法

• 批准号: 22K08365
• 负责人: 森山 能仁
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Tokyo Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K08365/
• 关键词: カベオラ; 糸球体内皮細胞; 糸球体上皮細胞; アルブミン; エンドサイトーシス; ゲニステイン

これまで我々はアルブミン尿の新機序としてカベオラを介し糸球体内皮細胞・糸球体細胞内を通過する経路を解明・報告し、更にカベオラエンドサイトーシスを阻害することによりアルブミン尿の減少効果が得られることを証明してきた。本研究ではカベオラ経路を薬剤の投与で阻害することによりアルブミン尿の減少効果の得られる新規薬剤を探索することで腎疾患において普遍的に治療できる薬剤の探索を目的としている。本年度は、カベオラエンドサイトーシスの際にreactive oxygen species(ROS)によってSrcキナーゼが活性化され、続いてカベオリン-1が活性化によりカベオラが増殖すること、カベオラが細胞膜から切断されエンドサイトーシスすることに着目し、Srcキナーゼ阻害効果のある、大豆イソフラボンに多く含有される植物性エストロゲンであるゲニステインを使用し実験を進めた。まずゲニステインの糸球体上皮・内皮細胞に対する投与における適正濃度を調べるために、LDH放出試験にて細胞毒性試験を確認し200ug以下と決定した。続いて50ug, 100ugそして200ugのdose dependentにゲニステインの前投与後に30分、60分、120分でtime courseでアルブミンを投与後に免疫染色でカベオリン-1の発現と細胞内のアルブミン量を測定したところ、経時的にアルブミン量は増加し、用量依存性にゲニステインの投与でカベオリン-1の発現は低下し、それに伴いアルブミン量も減少した。また、western blotでも細胞内アルブミン量はゲニステイン用量依存に低下した。この結果よりアルブミンの糸球体上皮・内皮細胞のカベオラ介在性エンドサイトーシスがゲニステインにより阻害されることが明確になった。

到目前为止，我们已经阐明并报道了一种新的蛋白尿机制，这是一种通过小凹穿过肾小球内皮细胞和肾小球细胞的途径，而且，抑制小凹内吞作用可以减少蛋白尿。在本研究中，我们的目标是寻找一种通过抑制小窝途径来减少蛋白尿的新药，从而找到一种可以普遍治疗肾脏疾病的药物。今年，我们将重点研究在小窝内吞过程中，Src 激酶被活性氧 (ROS) 激活，并且小窝由于随后的 Caveolin-1 激活而增殖，并且小窝从细胞膜上裂解并被内吞。 ，我们使用染料木黄酮进行了实验，染料木黄酮是大豆异黄酮中发现的一种植物雌激素，具有 Src 激酶抑制作用。首先，为了检查金雀异黄素对肾小球上皮细胞和内皮细胞给药的适当浓度，我们使用LDH释放试验确认了细胞毒性试验，并将其确定为200ug以下。预给予金雀异黄酮后 30、60 和 120 分钟，随后分别剂量依赖 50ug、100ug 和 200ug当我们在疗程期间施用白蛋白后通过免疫染色测量caveolin-1的表达和细胞内白蛋白的量时，我们发现白蛋白的量随着时间的推移而增加，而caveolin-1的表达随着以一定剂量施用金雀异黄酮而减少。依赖性，白蛋白含量相应减少。此外，在蛋白质印迹分析中，细胞内白蛋白水平以金雀异黄素剂量依赖性方式降低。这些结果清楚地表明，肾小球上皮细胞和内皮细胞中小窝介导的白蛋白内吞作用被金雀异黄素抑制。