Elucidating of molecular mechanism by which endocytosis regulates NLRP3 inflammasome formation and its phycological significance

阐明内吞作用调节NLRP3炎症小体形成的分子机制及其生理学意义

基本信息

批准号：
22K07140
负责人：
森田林平
金额：
$ 2.66万
依托单位：
Nippon Medical School
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

エンドサイトーシスは、クラスリン重鎖と軽鎖から成るクラスリン被覆小胞により病原体や外部物質を細胞内に取り込む機構であり、取り込まれた病原体や物質はNLRP3インフラマソームの形成を誘導しIL-1b/ IL-18の産生を引き起こす。この様にエンドサイトーシスはインフラマソーム形成誘導因子の取り込みに重要である。既に申請者はクラスリン重鎖（CHC）がNLRP3の結合因子であることを見出している。そこで本研究では「エンドサイトーシスはCHCを介してNLRP3インフラマソーム形成を制御する」という仮説の元に研究を進めてきた。先ず、NLRP3とCHCの様々な部位欠損変異体の発現ベクターを作成し、293T細胞に発現させ、免疫沈降法によりNLRP3とCHCの結合部位を決定した。その結果、NLRP3のLRRドメインとNACHTドメインの前半部位が共にCHCの結合に重要であり、一方、CHCでは繰り返し構造部位（R1～R6）がNLRP3との結合に重要であることが明らかとなった。興味深いことに、NLRP3のNACHTドメインの前半部位はATP結合部位、CHC繰り返し構造部位（R5～R6）はクラスリン軽鎖（CLC）結合部位であることから、NLRP3はCLCと競合してCHCに結合し、CHCはNLRP3のATP結合を制御することが予想された。実際に私達はin vitroにてCLCはNLRP3とCHCの結合効率を阻害することを明らかにした。更にCHCはNLRP3に結合することでNLRP3のATPase活性を促進することを見出した。これらの所見は、エンドサイトーシスはNLRO3インフラマソームの形成を遠隔コントロールすることを示唆する。

内吞作用是由网格蛋白涂层的囊泡组成的机制，由网状蛋白重和轻链组成，将病原体和外部物质掺入细胞中，并且掺入的病原体和物质诱导NLRP3炎症的形成并导致IL-1B/IL-18的产生。因此，内吞作用对于吸收炎症体形成因子很重要。申请人已经发现，网格蛋白重链（CHC）是NLRP3的结合因子。因此，这项研究是基于“内吞作用调节NLRP3炎性体形成的假设”进行的。首先，制备了NLRP3和CHC各种位点缺陷突变体的表达矢量，在293T细胞中表达，并通过免疫沉淀确定NLRP3和CHC的结合位点。结果，据揭示了NLRP3的NACHT结构域的LRR结构域和NACHT结构域的前半部分对于CHC结合很重要，而在CHC中，重复的结构位点（R1至R6）对于与NLRP3的结合都很重要。有趣的是，由于NLRP3的NACHT结构域的前半段是ATP结合位点，CHC重复结构位点（R5-R6）是网格蛋白轻链（CLC） - 结合位点，因此可以预测NLRP3在与CLC竞争中与CLC竞争中的CHC结合，并且CHC调节位置ATP ATP与Nlrp3的结合。实际上，我们已经表明CLC在体外抑制了NLRP3和CHC的结合效率。此外，发现CHC通过与NLRP3结合来促进NLRP3的ATPase活性。这些发现表明，内吞作用远程控制了NLRO3炎症体的形成。