Analysis of the action mechanism of cytoadherence inhibiting antibodies to Mycoplasma pneumoniae and application to vaccine antigen design.

肺炎支原体细胞粘附抑制抗体作用机制分析及其在疫苗抗原设计中的应用

基本信息

批准号：
22K07063
负责人：
見理剛
金额：
$ 2.66万
依托单位：
National Institute of Infectious Diseases
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

项目摘要

M. pneumoniae の細胞接着を強く阻害する抗P1モノクローナル抗体（P1-MC4）は、P1タンパク質のC末端側を抗原として作製された。このP1-MC4が認識するエピトープを特定するため、P1タンパク質のC末側を連続的に断片化したペプチドを準備し、P1-MC4との反応性を調べた。その結果、P1-MC4が認識するのはP1の13アミノ酸残基T1426-D1438（TDLFDPVTMLVYD）であることがわかった。P1の結晶構造では、この配列はC末ドメインの中にあるループ構造にあたる。この部位は、P1とP40/P90 が2分子ずつで形成する細胞接着タンパク質複合体 (Nap) では、複合体の内側になると考えられる。Napが閉じた構造の時は抗体はエピトープにアクセスできないと考えられる。この部位に抗体がアクセスし、細胞接着阻害活性を発揮するのはNapが機能する際に動的な構造変化を起こし開いた構造をとっている可能性が考えられる。これは M. pneumoniaeの細胞接着性や滑走運動のメカニズムを考える上で有用な情報であり、P1-MC4とP1の結合状態の詳細な解析が望まれる。今後、P1-MC4と P1が結合した状態の構造解析を行うため、前段階として、P1-MC4のアミノ酸配列分析を行った。P1-MC4を生産するハイブリドーマからmRNAを抽出し、cDNAの塩基配列を分析した。その結果、ハイブリドーマからは1本の抗体H鎖と 2本の L鎖のmRNAが検出された。P1-MC4は2種のL鎖が混合したモノクローナル抗体であったことがわかった。このH鎖と2本の L鎖の配列はAccession No.LC600310、LC600311、LC600312でデータベースに登録した。P1-MC4 は、L鎖が2種類含まれているため、Fab断片の結晶化による構造解析は困難であると予想された。

使用 P1 蛋白的 C 末端侧作为抗原制备了抗 P1 单克隆抗体 (P1-MC4)，它能强烈抑制肺炎支原体细胞粘附。为了鉴定P1-MC4识别的表位，我们制备了P1蛋白C末端连续片段化的肽，并检查了其与P1-MC4的反应性。结果发现，P1-MC4识别P1的13个氨基酸残基T1426-D1438(TDLFDPVTMLVYD)。在 P1 的晶体结构中，该序列对应于 C 端结构域内的环结构。该位点被认为位于细胞粘附蛋白复合物 (Nap) 内部，该复合物由 P1 和 P40/P90 两个分子形成。人们认为，当 Nap 处于封闭结构时，抗体无法接近表位。抗体可能会进入该位点并发挥细胞粘附抑制活性，因为 Nap 在发挥作用时会经历动态结构变化并采用开放结构。当考虑肺炎支原体的细胞粘附和滑行运动机制时，这是有用的信息，并且需要对 P1-MC4 和 P1 的结合状态进行详细分析。为了将来分析P1-MC4和P1的结合态结构，我们作为初步步骤对P1-MC4进行了氨基酸序列分析。从产生P1-MC4的杂交瘤中提取mRNA，并分析cDNA碱基序列。结果，在杂交瘤中检测到1个抗体H链和2个L链mRNA。事实证明，P1-MC4是一种混合了两种L链的单克隆抗体。该H链和两条L链的序列以登录号LC600310、LC600311和LC600312在数据库中登记。由于P1-MC4含有两种类型的L链，预计通过结晶Fab片段进行结构分析会很困难。