ゲノム情報にもとづくM.Pneumoniaeの細胞構造の理解と病原性の解明

基于基因组信息了解肺炎支原体的细胞结构和致病性

基本信息

批准号：
17019067
负责人：
見理剛
金额：
$ 2.75万
依托单位：
National Institute of Infectious Diseases
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

M.pneumoniaeの全689個のORFのうち200個をInvitrogen社のGatewayシステムのベクターにクローン化した。このうち約100個をEYFPの遺伝子と連結してM.pneumoniaeで発現させ、細胞内局在を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、接着器官に存在することが知られていた7つのタンパク質のうち、HMW1、HMW2、HMW3、P30、P65の5つでは接着器官部分に明るい蛍光が観察され、EYFPタグを付けたことによって局在を視覚化することができた。しかし、P1とORF6はうまく視覚化することができなかった。EYFP蛍光タグ法はM.pneumoniaeのORF産物の細胞内局在を調べる手段としておおむね有効ではあるが、ORFによっては正確な結果が得られない場合があるので注意する必要がある。その他、今回調べたORFのうち、明らかに再現性のある局在パターンを示したのは約10個だった。P41、P24、P200は、接着器官の基部に局在していることが観察された。これらはM.penumoniaeをTritonX-100で処理した時に不溶画分に残ることからも、細胞骨格成分であると考えられる。また酵素と考えられる数個のORF産物と、機能未知のORF産物も接着器官付近に局在した。現在これらの接着器官部位での局在をさらに確認している。再現性のある局在パターンを示したORF産物についてはEYFPとECFPの二つの蛍光タグを用いて局在部位の比較を行った。この方法の分解能は比較的高く、数十nm程度の局在部位の違いを蛍光像のずれとして検出できた。この分析からは、これまで免疫蛍光法では同じ部位に存在していると考えられていたHMW1とHMW3タンパク質が、HMW3の方が接着器官の末端側にHMW1はより基部側に存在していることがわかった。

在肺炎支原体的总共 689 个 ORF 中，有 200 个被克隆到 Invitrogen 的 Gateway 系统载体中。其中大约 100 个与 EYFP 基因连接并在肺炎支原体中表达，使用荧光显微镜观察它们的细胞内定位。结果，在已知存在于粘附器官中的七种蛋白质中的五种(HMW1、HMW2、HMW3、P30和P65)的粘附器官区域中观察到明亮的荧光，并且定位可以被可视化。然而，P1 和 ORF6 无法很好地可视化。虽然 EYFP 荧光标记方法作为研究肺炎支原体 ORF 产物的细胞内定位的手段通常是有效的，但必须小心，因为根据 ORF 可能无法获得准确的结果。此外，这次检查的大约 10 个 ORF 显示出清晰可重复的定位模式。观察到 P41、P24 和 P200 位于粘附器官的基部。由于当用 TritonX-100 处理肺炎支原体时，这些物质仍保留在不溶性部分中，因此它们被认为是细胞骨架成分。一些被认为是酶的 ORF 产物和功能未知的 ORF 产物也位于粘附器官附近。我们目前正在进一步确认这些位点在粘连器官中的定位。对于显示可重复定位模式的 ORF 产品，使用两种荧光标签 EYFP 和 ECFP 比较定位位点。该方法的分辨率较高，可以将几十纳米的局部区域差异检测为荧光图像的偏差。该分析表明，以前使用免疫荧光被认为存在于同一位点的 HMW1 和 HMW3 蛋白被发现存在于粘连器官的远端侧，而 HMW1 存在于器官 I 的近侧。理解。