Analysis of lipid domains around receptor tyrosine kinases by super-resolution microscopy

通过超分辨率显微镜分析受体酪氨酸激酶周围的脂质结构域

• 批准号: 22K06609
• 负责人: 阿部 充宏
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2026-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-22K06609/
• 关键词: 受容体型チロシンキナーゼ; EGFR; 脂質ラフト; ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸; 超解像顕微鏡; 一分子イメージング; 脂質ドメイン; 細胞膜

過去の生化学的な解析から、受容体型チロシンキナーゼは、脂質ラフトに局在することが示唆されていた。本研究では、「脂質プローブ」と「超解像顕微鏡法」とを組み合わせることにより、受容体型チロシンキナーゼが脂質ラフトに局在するか、受容体型チロシンキナーゼが脂質ラフト中の脂質によって活性制御されるか、を明らかにすることを目的とする。本年度は、代表的な受容体型チロシンキナーゼであるEGFRが、どの脂質ドメインに存在するかを調べるために、EGFRと脂質プローブとの共局在解析を超解像顕微鏡によって行った。脂質プローブとして、SMに対してはEquinatoxin II、クラスター化したSMに対してはLysenin、SM/Chol複合体に対してはNakanori、Cholに対してはD4H、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸 (PIP2) に対してはPLC delta-PH、ホスファチジルイノシトール3,4,5-トリスリン酸 (PIP3) に対してはGRP1-PH、ホスファチジルセリン (PS) に対してはevectin2-PHを用いた。超解像顕微鏡の共局在率はRipley’s bivariate K-functionで評価した。その結果、EGF刺激前には、EGFRはPIP2と高い頻度で共局在が観察された。ところが、EGF刺激後には共局在が低下することが分かった。一分子イメージング法でも検証した結果、同様の結果が得られた。この共局在の低下は、PLC gammaによって、EGFR周囲のPIP2が分解されるためであることが示唆された。また、EGFR以外の受容体型チロシンキナーゼについて、ヒトのcDNAから50種類以上をクローニングし、次年度以降の超解像顕微鏡による解析のための準備を行った。

先前的生化分析表明，受体型酪氨酸激酶位于脂质筏上。在这项研究中，通过结合“脂质探针”和“超分辨率显微镜”，目的是确定受体型酪氨酸激酶是否局部与脂质筏定位​​，以及受体型酪氨酸激酶是否由脂质中的脂质控制。 In this year, colocalization analysis of EGFR and lipid probes was performed using a super-resolution microscope to determine which lipid domains EGFR, a representative receptor tyrosine kinase, is present in. As lipid probes, Equinatoxin II was used for SM, Lysenin was used for clustered SM, Nakanori was used for SM/Chol complexes, D4H was used for Chol, PLC DELTA-PH用于磷脂酰肌醇4,5-双磷酸（PIP2），GRP1-PH用于磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3），并将EVECTIN2-PH用于磷脂酰羟赛氨酸（PS）。使用Ripley的双变量K功能评估了超分辨率显微镜的共定位率。结果，在EGF刺激之前，使用PIP2高频观察到EGFR共定位。但是，发现在EGF刺激后共定位降低。作为单个分子成像法获得了相同的结果。由于PLC伽马在EGFR周围降低了PIP2，因此提出了共定位的减少。此外，除EGFR以外的其他50种类型的受体型酪氨酸激酶是从人cDNA克隆的，并在下一个财政年度及以后进行了超分辨率显微镜进行分析。