ミトコンドリアを欠失させた真核細胞の構築とその分子細胞生物学的解析

缺乏线粒体的真核细胞的构建及其分子和细胞生物学分析

基本信息

批准号：
21K19204
负责人：
高橋康弘
金额：
$ 3.99万
依托单位：
Saitama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-07-09 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-21K19204/
关键词：
鉄硫黄クラスター鉄硫黄タンパク質出芽酵母ミトコンドリア

项目摘要

2021年度は、バクテリアのFe-Sクラスター生合成系であるNIFマシナリーを酵母のサイトゾルで発現させた後に、ミトコンドリアISCマシナリーの必須成分であるJAC1とNFS1遺伝子の破壊を試みたところ、前者は破壊できたが、後者は破壊できないという結果になった。本年度、その要因を探るために種々の検討を行ったところ、JAC1遺伝子は、嫌気的な条件下であれば、NIFマシナリーの有無に関わらず破壊できることが判明した。一方、NFS1はシステイン脱硫黄酵素として、ミトコンドリアのFe-Sクラスター生合成系に硫黄を供給するだけでなく、サイトゾルや核のtRNA硫黄修飾系にも硫黄を供給することが知られている。そこで、ミトコンドリアへの移行配列を除去したNFS1のコピーをNIFマシナリーと共に酵母のサイトゾルで発現させ、ミトコンドリア型の正常なNFS1遺伝子を破壊するという実験を進めたが、これまで成功していない。そこで、別のFe-Sクラスター生合成系であるSUFマシナリーを酵母のサイトゾルで発現させた後に、NFS1遺伝子の破壊を試みたところ、この遺伝子の破壊株を初めて構築することができた。今回導入したSUFマシナリーは、嫌気条件下で遊離のS2-を硫黄源として機能するタイプを用いたが、得られたNFS1破壊株の表現型は、導入したSUFマシナリーの特性に合致していた。さらに、破壊株の表現型から、ミトコンドリア内のFe-Sタンパク質群（グルタミン酸合成酵素など）は機能していないが、サイトゾルや核のFe-Sタンパク質群は正常と推定された。

在2021财政年度，在细菌基于Fe-s簇的NIF机器上被摧毁，然后在酵母位置溶胶上表达，然后破坏了JAC1和NFS1基因，这是线粒体ISC机器的重要组成部分，但后者不能被摧毁。在这个财政年度，进行了各种检查以探索这些因素，发现在厌氧条件下，JAC1基因无论是否有NIF机器都可以在厌氧条件下破坏。另一方面，已知NFS1不仅为线粒体的Fe-S簇实时合成系统供应硫作为半胱氨酸驱逐舰酶，而且还向现场溶胶和核TRNA硫磺训练系统提供硫。因此，NFS1的副本与NIF机器一起在酵母位置溶胶上表达，该副本与NIF机器一起表达，并且已经进行了实验以破坏正常的线粒体-Type NFS1基因，但并未成功。因此，在Suf机器是另一种Fe-S簇实时合成之后，在酵母位点溶胶上表达了NFS1基因的破坏。这次引入的SUF机使用的类型将S2-的S2-作为异常下的S2-作为硫源，但是所获得的NFS1破坏应变符合引入的Suf机器的特性。此外，从破坏性菌株的表达类型中，线粒体中的Fe-S蛋白基（例如谷氨酸合成酶）（例如谷氨酸合成酶）不起作估计是正常的。