ヒト一倍体細胞を用いたオルガネラ膜間接着因子の探索と機能解析

利用人单倍体细胞寻找细胞器膜间粘附因子并进行功能分析

基本信息

批准号：
17J07322
负责人：
田代晋也
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J07322/
关键词：
オルガネラ間コンタクトミトコンドリア ER 小胞体 GFP

项目摘要

本研究の目的は哺乳類細胞においてミトコンドリア・ER間コンタクトを制御する因子を，遺伝学的スクリーニングにより同定することである。三年目の目標は，二年目でスクリーニングを行って同定したミトコンドリア・ER膜間コンタクトを制御する因子候補について、機能検証することである。本年度では、スクリーニングにより同定されたオルガネラ膜間でのsplit GFPの再構成を阻害する遺伝子について一過性発現による局在解析とsiRNAを用いた機能解析を行った。同定されていた遺伝子の中でも過去にコンタクトサイトへの寄与が報告されていない遺伝子について、まずミトコンドリアの形態への影響を調べた。siRNAによって発現を抑制した結果、これらの遺伝子のうちいくつかについてはミトコンドリアのチューブの長さを伸長させ、細胞内での分布などの形態に影響を与えた。これはER-ミトコンドリア間コンタクトがミトコンドリアの切断に関与することを考慮すると妥当な結果であると考えられた。またERは細胞内でのカルシウムの貯蔵庫としての役割を果たしており、ER-ミトコンドリア間コンタクトはミトコンドリア内のカルシウム濃度の調節に大きな影響を与えていると考えられている。そこで今回同定されたER-ミトコンドリア間を調節する候補因子のsiRNAによる発現抑制のカルシウムシグナリングへの影響を、ミトコンドリア内カルシウム濃度を蛍光強度によって可視化するタンパク質を用いて定量した。さらにこれら因子にFLAGもしくはGFPタグなどを付加したタンパク質を細胞内で過剰発現させ、抗体を用いた免疫染色法などで局在を検証した。これらの実験によりミトコンドリア・ER両オルガネラコンタクト部位に局在し，ミトコンドリア形態などに影響を与えた因子について相互作用相手を免疫沈降法などで探索している。

这项研究的目的是确定通过遗传筛查来调节哺乳动物细胞中线粒体 - 的接触的因素。第三年的目的是验证候选因素的功能特征，这些因素调节了第二年通过筛查确定的线粒体-ER膜间接触。在今年，使用瞬态表达和对基因的功能分析进行定位分析，这些基因抑制了通过筛选和siRNA识别的细胞器之间的分裂GFP的重建。在过去没有据报道有助于接触位点的确定基因中，我们首先研究了对线粒体形态的影响。由于siRNA抑制表达，其中一些基因扩大了线粒体管的长度，影响形态，例如细胞内的分布。考虑到线粒体裂解涉及ER线粒体接触，这被认为是合理的结果。此外，ER还可以用作细胞中钙的储层，而ER线粒体接触被认为对线粒体内钙浓度的调节具有重大影响。因此，使用蛋白质通过荧光强度来可视化线粒体中钙浓度的蛋白质确定抑制候选因子表达的候选因子表达的影响。此外，添加到这些因素中的具有FLAG或GFP标签的蛋白质在细胞内过表达，并使用抗体进行免疫染色来验证定位。这些实验已用于搜索相互作用伙伴，以了解在线粒体和ER细胞器接触位点所定位的因素，并使用免疫沉淀影响线粒体形态等。