ヒト一倍体細胞を用いたオルガネラ膜間接着因子の探索と機能解析

利用人单倍体细胞寻找细胞器膜间粘附因子并进行功能分析

基本信息

批准号：
17J07322
负责人：
田代晋也
金额：
$ 2.58万
依托单位：
Yamagata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-26 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J07322/
关键词：
オルガネラ間コンタクトミトコンドリア ER 小胞体 GFP

项目摘要

本研究の目的は哺乳類細胞においてミトコンドリア・ER間コンタクトを制御する因子を，遺伝学的スクリーニングにより同定することである。三年目の目標は，二年目でスクリーニングを行って同定したミトコンドリア・ER膜間コンタクトを制御する因子候補について、機能検証することである。本年度では、スクリーニングにより同定されたオルガネラ膜間でのsplit GFPの再構成を阻害する遺伝子について一過性発現による局在解析とsiRNAを用いた機能解析を行った。同定されていた遺伝子の中でも過去にコンタクトサイトへの寄与が報告されていない遺伝子について、まずミトコンドリアの形態への影響を調べた。siRNAによって発現を抑制した結果、これらの遺伝子のうちいくつかについてはミトコンドリアのチューブの長さを伸長させ、細胞内での分布などの形態に影響を与えた。これはER-ミトコンドリア間コンタクトがミトコンドリアの切断に関与することを考慮すると妥当な結果であると考えられた。またERは細胞内でのカルシウムの貯蔵庫としての役割を果たしており、ER-ミトコンドリア間コンタクトはミトコンドリア内のカルシウム濃度の調節に大きな影響を与えていると考えられている。そこで今回同定されたER-ミトコンドリア間を調節する候補因子のsiRNAによる発現抑制のカルシウムシグナリングへの影響を、ミトコンドリア内カルシウム濃度を蛍光強度によって可視化するタンパク質を用いて定量した。さらにこれら因子にFLAGもしくはGFPタグなどを付加したタンパク質を細胞内で過剰発現させ、抗体を用いた免疫染色法などで局在を検証した。これらの実験によりミトコンドリア・ER両オルガネラコンタクト部位に局在し，ミトコンドリア形態などに影響を与えた因子について相互作用相手を免疫沈降法などで探索している。

这项研究的目的是确定通过遗传筛查控制哺乳动物细胞中线粒体和ER接触的因素。第三年的目标是验证候选因子的功能，以控制第二年确定并确定的线粒体和ER膜接触。在这个财政年度，通过使用siRNA的瞬态表达和功能分析进行了定期分析，通过定期分析来抑制通过筛选鉴定的有机膜之间重建GFP的基因。在过去的基因中，在鉴定的基因中，我们首先检查了线粒体的影响。由于siRNA抑制表达，其中一些基因扩展到线粒体管的长度，并影响细胞中分布的形式。考虑到跨越跨种族间断开，这被认为是合理的结果。 ER还可以作为细胞中钙的储存作用，被认为对调节线粒体的钙浓度有重大影响。因此，使用蛋白质来量化了鉴定出这种鉴定的ER线粒体之间对候选因子的钙信号传导的影响。此外，在细胞中过度表达了包含FLAG或GFP标签的过量蛋白质，并使用使用抗体的免疫类方法对定位进行了验证。这些实验位于线粒体和ER有机接触位点，并正在探索影响线粒体形式的因素的相互作用伴侣。