患者由来乳歯幹細胞を用いた肝疾患病因解析と幹細胞治療

利用患者来源的乳牙干细胞分析肝病发病机制和干细胞治疗

• 批准号: 17J03382
• 负责人: 園田 聡一朗
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-04-26 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J03382/
• 关键词: 乳歯幹細胞; 肝組織再生; 胆道閉鎖症; エピジェネティクス

胆道閉鎖症患者由来乳歯幹細胞（BA-SHED）における胆管上皮細胞分化能の解析のために、マトリゲルを用いた三次元培養法を取り入れた分化誘導を行い、色素取り込みを伴う胆管上皮細胞様細胞による管状構造の形成に成功した。特異的なケラチンタンパク質であるCK19の遺伝子発現は誘導終了時に低下していたが、免疫蛍光染色にてタンパク質の局在が認められた。これまでの研究で、BA-SHEDにおけるHNF6の過剰発現を明らかにした。さらに、健常SHEDと比較して、BA-SHEDのHNF6プロモータ領域におけるクロマチンアクセシビリティ上昇を明らかにした。また、健常SHEDをTNF-alphaおよびIFN-gammaにて共刺激すると、BA-SHEDと同様のクロマチンアクセシビリティを示すことを明らかにした。これらの結果から、炎症性の刺激によりBA-SHEDのHNF6発現に対する病的なエピジェネティック制御が生じている可能性が示唆される。加えて、BA-SHEDでは、胆道上皮細胞の分化において重要であるTGFBR2の遺伝子発現が低下していることを明らかにした。TGFBR2の発現はHNF6により制御されることが知られており、BA-SHEDにおいてHNF6発現上昇がTGFBR2の発現を制御している可能性がある。また疾患モデルとして、CRISPR-dCas9システムを用いてHNF6遺伝子を過剰発現させた健常SHEDの作成に成功した。さらに、BA-SHEDの正常化とその解析を行った。プレドニゾロン処理による炎症性のシグナル阻害では、BA-SHEDの正常化は認められなかった。一方、siRNAにより、BA-SHEDのHNF6遺伝子発現を抑制し、HNF6タンパク発現の抑制を確認した。従って、siRNAによるHNF6発現抑制によるBA-SHEDの正常化が有効であると考えられる。

为了分析来自胆道闭锁患者的乳牙干细胞（BA-SHED）的胆道上皮细胞分化潜力，我们使用Matrigel通过三维培养方法诱导分化，并开发了胆管上皮细胞样细胞成功形成管状结构。 CK19（一种特定的角蛋白）的基因表达在诱导结束时下降，但通过免疫荧光染色观察到该蛋白的定位。先前的研究揭示了 BA-SHED 中 HNF6 的过度表达。此外，我们发现与健康 SHED 相比，BA-SHED 的 HNF6 启动子区域染色质可及性有所增加。我们还发现，当健康的 SHED 与 TNF-α 和 IFN-γ 共同刺激时，它表现出与 BA-SHED 相似的染色质可及性。这些结果表明炎症刺激可能引起 BA-SHED 中 HNF6 表达的病理表观遗传调控。此外，BA-SHED显示，对胆管上皮细胞分化很重要的TGFBR2基因表达下降。已知 TGFBR2 的表达受 HNF6 调节，HNF6 表达增加可能控制 BA-SHED 中 TGFBR2 的表达。此外，作为疾病模型，我们使用 CRISPR-dCas9 系统成功创建了过度表达 HNF6 基因的健康 SHED。此外，我们对 BA-SHED 进行归一化并进行分析。通过泼尼松龙治疗抑制炎症信号并不能使 BA-SHED 正常化。另一方面，我们使用siRNA抑制BA-SHED中的HNF6基因表达，并证实了HNF6蛋白表达的抑制。因此，通过使用 siRNA 抑制 HNF6 表达来标准化 BA-SHED 被认为是有效的。