患者由来乳歯幹細胞を用いた肝疾患病因解析と幹細胞治療

利用患者来源的乳牙干细胞分析肝病发病机制和干细胞治疗

• 批准号: 17J03382
• 负责人: 園田 聡一朗
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2017
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2017-04-26 至 2019-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17J03382/
• 关键词: 乳歯幹細胞; 肝組織再生; 胆道閉鎖症; エピジェネティクス

胆道閉鎖症患者由来乳歯幹細胞（BA-SHED）における胆管上皮細胞分化能の解析のために、マトリゲルを用いた三次元培養法を取り入れた分化誘導を行い、色素取り込みを伴う胆管上皮細胞様細胞による管状構造の形成に成功した。特異的なケラチンタンパク質であるCK19の遺伝子発現は誘導終了時に低下していたが、免疫蛍光染色にてタンパク質の局在が認められた。これまでの研究で、BA-SHEDにおけるHNF6の過剰発現を明らかにした。さらに、健常SHEDと比較して、BA-SHEDのHNF6プロモータ領域におけるクロマチンアクセシビリティ上昇を明らかにした。また、健常SHEDをTNF-alphaおよびIFN-gammaにて共刺激すると、BA-SHEDと同様のクロマチンアクセシビリティを示すことを明らかにした。これらの結果から、炎症性の刺激によりBA-SHEDのHNF6発現に対する病的なエピジェネティック制御が生じている可能性が示唆される。加えて、BA-SHEDでは、胆道上皮細胞の分化において重要であるTGFBR2の遺伝子発現が低下していることを明らかにした。TGFBR2の発現はHNF6により制御されることが知られており、BA-SHEDにおいてHNF6発現上昇がTGFBR2の発現を制御している可能性がある。また疾患モデルとして、CRISPR-dCas9システムを用いてHNF6遺伝子を過剰発現させた健常SHEDの作成に成功した。さらに、BA-SHEDの正常化とその解析を行った。プレドニゾロン処理による炎症性のシグナル阻害では、BA-SHEDの正常化は認められなかった。一方、siRNAにより、BA-SHEDのHNF6遺伝子発現を抑制し、HNF6タンパク発現の抑制を確認した。従って、siRNAによるHNF6発現抑制によるBA-SHEDの正常化が有効であると考えられる。

为了分析胆管周围患者胆管上皮细胞分化的能力，使用三维培养方法使用Matrigel诱导了分化，并通过胆管上皮细胞样细胞成功地形成了管状结构。 CK19的基因表达是一种特异性角蛋白蛋白，在诱导结束时降低，但免疫荧光染色显示蛋白质定位。先前的研究表明，BA-Shed中HNF6的过表达。此外，我们揭示了与健康的棚屋相比，BA-SHED的HNF6启动子区域的染色质可及性提高。此外，据揭示，当健康的棚与TNF-Alpha和IFN-Gamma共同刺激时，它与BA-Shed具有类似的染色质可及性。这些结果表明，炎症刺激可能导致BA-SHED中HNF6表达的病理表观遗传调节。此外，BA-SHED显示TGFBR2的基因表达降低，这在胆道上皮细胞分化中很重要。众所周知，TGFBR2的表达受HNF6调节，并且在BA-Shed中升高HNF6表达可能调节TGFBR2表达。此外，作为一种疾病模型，我们成功地创建了使用CRISPR-DCAS9系统过表达HNF6基因的健康棚。此外，进行了BA-SHED和分析的归一化。通过泼尼松龙治疗抑制炎症信号不会使BA-SHED正常化。另一方面，siRNA抑制了BA-Shed中HNF6基因的表达，并确认HNF6蛋白的表达被抑制。因此，人们认为，通过抑制siRNA抑制HNF6表达的BA-SHED归一化是有效的。