ペプチドタグを用いたタンパク質のアモルファス凝集体の制御及びその細胞毒性の解析

使用肽标签控制无定形蛋白聚集体并分析其细胞毒性

基本信息

批准号：
17F17392
负责人：
黒田裕
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-11-10 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

タンパク質の不定形な凝集（アモルファス凝集）は、創薬やバイオ産業において重要な現象であるにもかかわらず、その物理化学的特徴解析及び生物学的影響は殆ど解明されていない。本計画では、受入研究者が独自に開発した3～7残基から成る溶解性制御タグ(Solubility Controlling Peptide；SCPタグ)を用いてタンパク質(デング4型由来エンベロープ糖タンパク質第3ドメイン、以下DEN4-ED3)を不定形な可溶性凝集体(soluble amorphous aggregates)に会合させた。くわえて、SCPタグ配列を変異させることで凝集体のサイズを制御し、不定形で可溶な凝集体を安定的に形成させ、凝集の物性や構造を動的光散乱法などの分光学的手法を用いて明らかにした。また、単量体では無毒なDEN4-ED3にSCPタグを付加し可溶性会合体を形成させると細胞毒性を有することを解明した。さらに、可溶性会合体が大きな凝集体に成長すると細胞毒性が失われるということも見出した。神経変性疾患の原因分子とされているアミロイドでも類似した観測がされており、アミロイド線維核（pre-fibril）は毒性を有し、線維に成長したアミロイドは細胞毒性を失うという報告が多くなされている。しかし、アモルファス凝集では我々が知る限り初めての報告である。以上のことから、タンパク質が比較的小さなアモルファスな会合体を形成すると細胞毒性が生ずることを解明した。なお、現在執筆中の論文においては、外国人特別研究員Velmurugan氏が執筆した原稿を基に論文を共同で仕上げて投稿する予定であったが、コロナウイルス流行のため、執筆が遅れている。

尽管蛋白质的无定形聚集是药物发现和生物工业中的重要现象，但其理化特性和生物学效应在很大程度上是未知的。在本项目中，我们利用宿主研究人员自主研发的由3至7个残基组成的溶解度控制肽（SCP标签）来组装分析蛋白质（登革热4型衍生包膜糖蛋白第三结构域，以下简称DEN4-ED3）成可溶性无定形聚集体。此外，通过突变SCP标签序列，我们可以控制聚集体的大小，稳定地形成无定形和可溶性聚集体，并使用动态光散射等光谱方法研究聚集体的物理性质和结构。方法。我们还发现，单体形式无毒的 DEN4-ED3 在添加 SCP 标签形成可溶性聚集体时会变得具有细胞毒性。此外，我们发现当可溶性聚集体长成大聚集体时，细胞毒性就会消失。对淀粉样蛋白也进行了类似的观察，淀粉样蛋白被认为是神经退行性疾病的致病分子，并且有许多报道称淀粉样蛋白原纤维核（前原纤维）具有毒性，并且已经长成原纤维的淀粉样蛋白失去细胞毒性。。然而，据我们所知，这是第一份关于无定形聚集的报告。基于上述，我们发现当蛋白质形成相对较小的无定形聚集体时，就会发生细胞毒性。目前正在撰写的论文原计划根据外籍研究员Velmurugan撰写的手稿共同完成并提交，但由于冠状病毒的爆发，写作被推迟了。