アミノ酸配列単純化法を用いた蛋白質のフォールディング・溶解度を定量的に調べる研究

利用氨基酸序列简化法定量研究蛋白质折叠和溶解度的研究

基本信息

批准号：
16041247
负责人：
黒田裕
金额：
$ 7.1万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture and Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

天然蛋白質の配列は、その立体構造を決定する視点から、「雑音」となる様々な情報を含む。そこで、我々は以前、仔牛膵臓トリプシン阻害蛋白質(BPTI)の構造及び活性を変えずに、雑音となる情報の冗長性を除いた単純化アミノ酸配列の作製が可能であると実験的に示した。「単純化配列」とは、構造安定性への寄与が小さい残基位置をスペーサー役のアラニンに置き換えた配列を示す。本研究課題では、単純化酸配列からなる蛋白質と天然配列から成る蛋白質の比較から、蛋白質の構造形成・構造安定性及び溶解性の分子機構を、定量的に解明することを目指して研究を進め、以下の成果を得た。1.配列を単純化した6種類のBPTI変異体(BPTI-[5,55],-21,-22,-26,-27)のDSC測定を行い、変生に伴うエンタルピー差(ΔH_<vH>及びΔH_<cal>)、エントロピー差(ΔS)、変性温度(Tm)と熱容量差(ΔCp)を求め、単純化配列からなる蛋白質の熱力学を初めて明らかにした(長岡技術大学・城所俊一博士と共同研究)。2.BPTI-21に2つの変異を導入したダブル変異体(BPTI-21/A14V・A38G)の安定性がBPTI-21より10℃以上高いことを明らかにした。現在、それぞれの単独変異の安定化への寄与を調べるため、BPTI-21/A14V及び-21/A38G(シングル変異体)を構築し、解析中である。3.蛋白質の溶解度を向上させる一般的な方法の開発。我々は、BPTI-22のN末及びC末に10残基程度の短い親水性配列を付加することで、溶解度が最大で5倍向上することを明らかにした。溶解度を向上させることで、従来の1/8の時間でNMR(HSQC)が測定可能になり、SN比、ピーク形態が共に改善された。この手法は、対象蛋白質の配列を変えないため、一般的な方法となることが期待される。(東京大学・桑島邦博博士との共同研究)

天然蛋白质的序列包含各种信息，从确定其三维结构的角度来看，这些信息构成了“噪音”。因此，我们之前已经通过实验证明，在不改变小牛胰腺胰蛋白酶抑制蛋白（BPTI）的结构和活性的情况下，可以创建一个简化的氨基酸序列，消除冗余的噪声信息。 “简化序列”是指其中对结构稳定性贡献很小的残基位置被用作间隔区的丙氨酸取代的序列。在本研究项目中，我们旨在通过比较简化酸序列的蛋白质和天然序列的蛋白质，定量阐明蛋白质结构形成、结构稳定性和溶解性的分子机制，获得以下结果。 1. 对简化序列（BPTI-[5,55],-21,-22,-26,-27）的六种BPTI突变体进行DSC测量，并进行热函差（ΔH_<vH>和ΔH_< Cal>）、熵差（ΔS）、变性温度（Tm）和热容差（ΔCp），首次阐明了由简化序列组成的蛋白质的热力学（与俊一博士的共同研究） Shirodokoro，长冈工业大学））。 2. 结果表明，在BPTI-21中引入两个突变的双突变体(BPTI-21/A14V・A38G)的稳定性比BPTI-21高10℃以上。我们目前正在构建和分析 BPTI-21/A14V 和 -21/A38G（单突变体），以研究每个单突变对稳定性的贡献。 3. 开发提高蛋白质溶解度的通用方法。我们发现，在 BPTI-22 的 N 端和 C 端添加约 10 个残基的短亲水序列可以将溶解度提高多达 5 倍。通过提高溶解度，NMR (HSQC) 的测量时间是传统方法的 1/8，并且 SN 比和峰形貌均得到改善。由于该方法不改变目标蛋白的序列，因此有望成为常用方法。（与东京大学桑岛邦宏博士共同研究）

项目成果

期刊论文数量（16）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Structural and functional characterization of a mutant of Pseudocerastes persicus natriuretic peptide

白角拟角藻利钠肽突变体的结构和功能表征

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
Protein and Peptide Letters 13(3)
影响因子：
0
作者：
M.M.Elmi;M.Amininasab;T.Hondoh;J.Kikuchi;Y.Kuroda;H.Naderi-Manesh;M.N.Sarbolouki
通讯作者：
M.N.Sarbolouki

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