ミクロセル融合を介して染色体ベクターを効率よく受容細胞に移入する技術の確立

建立通过微细胞融合将染色体载体有效转移至受体细胞的技术

• 批准号: 15K01291
• 负责人: 加藤 基伸
• 金额: $ 3万
• 依托单位: Tottori University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2015
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2015-04-01 至 2017-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15K01291/
• 关键词: 染色体ベクター; ミクロセル; 細胞融合

一般的な遺伝子導入に用いるベクターサイズは、プラスミドであれば10kb以下であり、宿主大腸菌から抽出したDNAをトランスフェクション法によって受容細胞に導入することができる。これに対し染色体ベクターは、動物細胞を「宿主」としサイズはMbオーダーに及ぶため、染色体ベクターのみをインタクトなDNAとして単離することはできない。このため染色体ベクターを供与細胞から受容細胞に移すには、染色体ベクターの担体としてのミクロセルを利用する。供与細胞にコルセミドを投与するとチューブリンタンパク質の重合が阻害され、染色体分配と細胞質分裂を伴わず細胞周期が進行し、核膜再構築が起きて多数の微小核が形成される。さらに供与細胞にアクチンタンパク質の重合阻害剤であるサイトカラシンを投与し遠心力をかけると、細胞膜の破断と修復が生じ、細胞内容を包摂するミクロセルが形成される。現状ではヘテロな集団であるミクロセルと受容細胞との融合により目的細胞が得られる率は、受容細胞あたり「10の6乗分の1」程度である。染色体ベクターを含むミクロセル画分のみを選択的に分取できれば染色体ベクターの移入効率は飛躍的に増加することが見込まれる。初年度には、蛍光融合タンパク質による染色体ベクター標識の妥当性について検討した。染色体ベクター標識のための蛍光融合ヒストンH2Bタンパク質発現ベクターを構築し、Cre/loxPシステムを利用した部位特異的組換え挿入反応を利用して、供与細胞であるCHO細胞内にて人工染色体ベクター上に挿入した。蛍光融合ヒストンH2Bタンパク質の発現、細胞核への局在が確認でき、コルセミド投与による微小核形成過程の経時変化が追跡可能となった。

对于质粒而言，用于基因转移的载体大小通常为10 kb或更少，并且可以通过转染方法将从宿主大肠杆菌中提取的DNA引入受体细胞中。相反，由于动物细胞是“宿主”，并且其大小范围范围为MB，因此不能将染色体向量分离为完整的DNA。因此，为了将染色体载体从供体细胞转移到受体细胞中，使用了微孔作为染色体载体的载体。胸腺鞘施用对供体细胞的施用会抑制微管蛋白的聚合，并且细胞周期在没有染色体分布和细胞因子的情况下进展，从而导致核重建，从而形成了许多微核。此外，当将供体细胞施用到细胞切拉斯蛋白时，施加了肌动蛋白蛋白聚合和离心力的抑制剂，会发生细胞膜断裂和修复，并形成细胞含量，涵盖细胞含量。当前，通过当前是异源群体的微孔之间的融合可以获得目标细胞的速率，受体细胞的速率大约是“每个受体细胞10”的第六功率之一。如果只能选择性地收集含有染色体载体的微孔级分，则预计染色体载体的转移效率将大大增加。在第一年，研究了使用荧光融合蛋白的染色体载体标记的有效性。构建荧光融合组蛋白H2B蛋白H2B蛋白表达载体用于染色体载体标记，并使用CRE/LOXP系统使用位点特异性的重组插入反应构建供体细胞中的人造染色体载体Cho细胞中的人造染色体载体。确认了荧光融合的组蛋白H2b蛋白和定位到细胞核的表达，从而可以追踪由胸甲胺给药引起的微核过程的时间过程。

项目成果

ミクロセル融合を介した染色体ベクター移入法の改良

通过微细胞融合改进染色体载体转移方法

• 发表时间: 2015
• 作者: 山本加奈恵;楠瀬未菜;中山祐二;井上敏明;押村光雄;加藤基伸
• 通讯作者: 加藤基伸