ハイブリッド染色体キャリヤーの開発とトランスジェニック鳥類作製への応用

杂交染色体载体的研制及其在转基因鸟类生产中的应用

基本信息

批准号：
15656210
负责人：
上平正道
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度における研究で、ハイブリッド染色体キャリヤーを使ってオボアルブミンプロモーターによって目的遺伝子を発現させるために、オボアルブミン遺伝子座へ相同組換えするためのベクターとして、オボアルブミンプロモーター領域とオボアルブミン構成遺伝子領域に挟んだ形でまず薬剤耐性遺伝子の発現カセットを組み込んだ後、薬剤耐性遺伝子発現カセットの上流にオボアルブミンプロモーターの制御によって発現するように目的遺伝子を導入したプラスミドベクターを作製した。今回、モデル目的遺伝子として、ヒト成長ホルモン遺伝子を用いたベクターをDT-40細胞にエレクトロポレーション法により遺伝子導入し、薬剤による選択でヒト成長ホルモン遺伝子が導入された細胞をスクリーニングした。PCR法による解析によってヒト成長ホルモン遺伝子がオボアルブミンプロモーター部位に挿入されていることを確認できた。遺伝子導入したDT-40細胞のコルセミド/サイトカラシンB処理によるミクロセル化誘導のための条件(濃度・誘導時間)検討を行い、密度勾配遠心によってミクロセルの回収が行えるかを調べたところ、まだ効率は低いもののミクロセルの回収が行えた。ハイブリッド染色体キャリヤーを誘導するためには、コルセミド/サイトカラシンB処理によるDT-40細胞のミクロセル誘導の前に、VSV-G発現ベクターの導入によってDT-40細胞膜上にVSV-Gを一過的に高発現させる必要があるので、VSV-G遺伝子導入条件やミクロセル化のタイミングの条件を検討した。これまでエレクトロポレーション法では高効率の遺伝子導入が困難であったため、今回はリポフェクション法によるDT-40細胞への遺伝子導入を行ったが、今のところ遺伝子導入効率があまり上がらず、今後も高効率にDT-40細胞へ遺伝子導入できるリポフェクション試薬のスクリーニングを行う必要がある。

In a study in the previous year, a plasmid vector was prepared in which the target gene was first incorporated into the drug resistance gene expression cassette sandwiched between the ovalbumin promoter region and the ovalbumin constituent gene region, and the target gene was introduced upstream of the drug resistance gene expression cassette to be expressed by the control of the ovalbumin promoter, as a vector for homologous重组对卵巢蛋白基因座，以便使用杂化染色体载体表达靶基因。在本文中，使用电穿孔方法将使用人类生长激素基因的载体引入DT-40细胞中，并通过药物选择筛选了用人类生长激素基因引入的细胞。 PCR分析证实，人类生长激素基因插入了卵蛋白启动子位点。我们研究了通过纯海与基因转染的DT-40细胞处理微细胞的条件（浓度和诱导时间），并研究了微电池是否可以通过密度梯度离心率回收微电池，尽管效率仍然很低，但微电池仍然可以恢复。为了诱导杂化染色体载体，有必要通过在微透球诱导DT-40细胞的情况下通过Corsemide/cytochalasin b治疗诱导DT-40细胞来瞬时地表达DT-40细胞膜VSV-G，因此我们研究了VSV-G Gene Gene egene Time Cranspration and Time coplatution of MicroCellutions of MicroCellutions的条件。到目前为止，电穿孔方法的高效基因转移一直很困难，因此这次我们使用LiPofection方法将基因转移到DT-40细胞中，但是目前，基因转移的效率并没有提高太大，因此有必要继续筛选脂肪分解试剂，可以将可以转移到具有高效率的DT-40细胞中。