カイコにおけるファンコニ貧血原因遺伝子群に依存したDNA修復経路の解析

家蚕范可尼贫血基因 DNA 修复途径分析

基本信息

批准号：
08J02957
负责人：
管原亮平
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2010
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J02957/
关键词：
DNA修復昆虫培養細胞タンパク質翻訳後修飾

项目摘要

カイコのFancD2は一過的に発現させた条件下で非常にモノユビキチン化されにくい現象は前年度までにすでに報告していたが、本年度は恒常的に発現させたFancD2はMMCという薬剤依存的に、高い割合でモノユビキチン化されるということを明らかにした。さらにこのユビキチン化には、FancI, FancL, FancMというタンパク質がそれぞれ要求され、Usplというタンパク質はモノユビキチン化に対し抑制的に働くということも、欠損細胞の系で明らかにした。さらに、ファンコニタンパク質がMMC薬剤に対する抵抗性に必要であるのかどうかを細胞増殖試験によって検討した結果、FancD2, FancI, FancL, FancMをそれぞれ欠損した細胞では、MMC薬剤に対して感受性を呈し、DNA二重鎖間架橋修復に必要であることが示唆された。次に、FancMについて詳細な解析を行った。ウェスタンブロットのバンドシフト解析によりFancMは培養細胞内で一過的に発現させた際、リン酸化修飾が起こっていることが明らかになった。昆虫ツーハイブリッドの系により、Mhfl, Rmilというタンパク質とそれぞれ相互作用することを明らかにした。FancMがこの二つのタンパク質と相互作用する領域はそれぞれ異なっており、Mhflとの相互作用ドメインの方が、RmilのそれよりN末端側であった。RMilとFancMの相互作用には、RMil上にある二つ目のOB-foldが必須であることも明らかになった。以上をまとめると、カイコのファンコニ経路では、ヒトの経路と類似した機構が保持されていると思われる。

去年我们已经报道过家蚕FancD2在瞬时表达的情况下极难被单泛素化，但今年我们发现组成型表达的FancD2依赖于一种叫做MMC的药物，表明它是高度单泛素化的。此外，我们在有缺陷的细胞系统中证明了这种泛素化需要蛋白质 FancI、FancL 和 FancM，并且蛋白质 Uspl 可以抑制单泛素化。此外，我们通过细胞增殖试验检查了Fanconi蛋白是否是MMC药物抗性所必需的，结果表明缺乏FancD2、FancI、FancL和FancM的细胞对MMC药物敏感并表现出DNA损伤。对于重链间交联的修复是必要的。接下来我们对FancM进行了详细的分析。 Western blot 的条带位移分析表明，FancM 在培养细胞中瞬时表达时会发生磷酸化。使用昆虫双杂交系统，我们发现该蛋白质分别与 Mhfl 和 Rmil 蛋白质相互作用。 FancM与这两种蛋白相互作用的区域不同，与Mhfl的相互作用域比与Rmil的相互作用域更靠近N端。研究还表明，RMil 上的第二个 OB 折叠对于 RMil 和 FancM 之间的相互作用至关重要。总之，蚕的范可尼途径似乎保留了与人类相似的机制。