転写リズムを生成する核内機能複合体の同定と生体リズム調整剤の開発

鉴定产生转录节律的核功能复合物和生物节律调节剂的开发

• 批准号: 18779004
• 负责人: 土居 雅夫
• 金额: $ 2.37万
• 依托单位: Kyoto University (2007)Kobe University (2006)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18779004/
• 关键词: 生体リズム; 遺伝子転写; PERIOD2; 視交叉上核; PER10D2; 視交叉上枝; GPCR

交付申請書に記載した研究目的・研究実施計画に沿って研究を行い、下記の成果を得た。生体リズムの形成維持を担う時計センターは、脳内視床下部に存在する視交叉上核(SCN)にある。SCNに発現する遺伝子群を網羅的に捕らえるため、高純度のSCN抽出RNA溶液を用いてDNAマイクロアレイ解析を行った。ここで得られた候補分子群の発現を確定する目的で、SCN組織切片を用いてさらにin situ hybridizationを行った。また、転写リズムの生成に関わる核内機能複合体の同定を目指し、時計発振ループの中枢因子PER2に結合する蛋白質(PER-binding protein,ここではPAPと呼ぶ)を検索した。PER2-PAP複合体を精製するため、Flagタグ付きのPER2蛋白質を発現する細胞株を作出した。PER2蛋白質が転写抑制因子として機能する特定の時間帯(血清刺激後8-14時間後)を狙って細胞を回収し、核抽出液に含まれるmPER2蛋白質複合体を抗Flag抗体カラムを用いてアフィニティー精製した。この複合体をグリセロールグラジエント法を用いてサイズ分画した後、アクリルアミドゲルに展開した。銀染色によって検出したタンパク質を質量分析解析に供し、PAPの候補となる新規分子を同定することに成功した。この分子の特性を知るため、組み換え蛋白質を調製し、これを抗原として使用することによりPAPを特異的に認識するための抗体を得た。

本研究按照资助申请中所述的研究目的和研究实施计划进行，取得了以下成果。负责形成和维持生物节律的时钟中心位于大脑下丘脑的视交叉上核（SCN）。为了全面捕获SCN中表达的基因组，我们使用高度纯化的SCN提取的RNA溶液进行DNA微阵列分析。为了确定此处获得的候选分子的表达，我们进一步使用SCN组织切片进行原位杂交。此外，为了鉴定参与转录节律产生的核功能复合物，我们寻找了一种与时钟振荡环路的核心因子PER2结合的蛋白质（PER结合蛋白，本文称为PAP）。为了纯化 PER2-PAP 复合物，我们创建了表达 Flag 标记的 PER2 蛋白的细胞系。在特定时间段（血清刺激后 8-14 小时）收获细胞，此时 PER2 蛋白发挥转录抑制因子的作用，并使用抗 Flag 抗体柱对核提取物中包含的 mPER2 蛋白复合物进行亲和靶向纯化。使用甘油梯度法对该复合物进行尺寸分级，然后在丙烯酰胺凝胶上显色。对银染色检测到的蛋白质进行质谱分析，成功鉴定出一种新的 PAP 候选分子。为了了解这个分子的特性，我们制备了重组蛋白，并用它作为抗原，获得了特异性识别PAP的抗体。

项目成果

Signaling mediated by the dopamine D2 receptor potentiates circadian regulation by CLOCK:BMAL1.

多巴胺 D2 受体介导的信号传导增强了 CLOCK:BMAL1 的昼夜节律调节。

• DOI: 10.1073/pnas.0510691103
• 发表时间: 2006-04-18
• 期刊: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
• 影响因子: 11.1
• 作者: I. Yujnovsky;J. Hirayama;M. Doi;E. Borrelli;P. Sassone
• 通讯作者: P. Sassone

時計遺伝子の転写機構

时钟基因转录机制

• 发表时间: 2006
• 作者: 土居 雅夫