体内時計の位相調節を司る新規時計関連遺伝子の同定

鉴定控制生物钟相位调节的新型时钟相关基因

基本信息

批准号：
02J07955
负责人：
土居雅夫
金额：
$ 1.6万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

交付申請書に記載した研究目的・研究実施計画に沿って研究を行い、下記の成果を得た。Z3細胞を用いた遺伝子機能の検定システムの構築に向け、レトロウィルスを用いた遺伝子導入方法を確立した。これと並行し、新規時計因子E4BP4のリン酸化を介した活性制御メカニズムに重点を置いてE4BP4蛋白質の機能解析を行った。まず、E4BP4のリン酸化はカゼインキナーゼ1ε(CK1ε)によって触媒されることを試験管内の化学反応として証明した。さらに培養細胞において、E4BP4蛋白質はCK1εによってリン酸化された後、プロテアソームを介して、分解されることを明らかにした。CK1εによるリン酸化は、E4BP4の蛋白質量を減少させるばかりではなく、同時に培養細胞内のE4BP4の転写抑制活性も低下させることが分かった。これら一連の結果は、生体内におけるE4BP4蛋白質の挙動と合致する。すなわち、ヒヨコ松果体のE4BP4はリン酸化を受けた後に蛋白質量が減少したことから、生体内においてもCK1εはE4BP4の蛋白質量を負に制御することによってE4BP4の活動の時期を調節している可能性が考えられる。ショウジョウバエやハムスターにおいてCK1εの変異が時計の発振異常を示すことが知られており、以前からCK1εの作用点である基質蛋白質が時計機能に重要な役割を担うと予想されていた。それゆえ、E4BP4がCK1εの下流の重要なエフェクター分子であるという発見は、E4BP4の生理的な重要性を裏付けるばかりでなく、時計疾患の治療にむけた創薬のターゲットを考える上でも非常に重要な知見を提供したと言える。

本研究按照资助申请中所述的研究目的和研究实施计划进行，取得了以下成果。我们建立了使用逆转录病毒的基因导入方法，以使用Z3细胞构建基因功能测定系统。与此同时，我们对 E4BP4 蛋白进行了功能分析，重点关注新型时钟因子 E4BP4 的磷酸化介导的活性控制机制。首先，我们通过体外化学反应证明E4BP4磷酸化是由酪蛋白激酶1ε（CK1ε）催化的。此外，在培养细胞中，我们发现 E4BP4 蛋白被 CK1ε 磷酸化，然后通过蛋白酶体降解。研究发现，CK1ε磷酸化不仅降低了E4BP4的蛋白量，而且降低了培养细胞中E4BP4的转录抑制活性。这一系列结果与E4BP4蛋白在体内的行为一致。也就是说，由于鸡松果体中E4BP4的蛋白量被磷酸化后减少，因此CK1ε也可能通过负向调节E4BP4的蛋白量来调节体内E4BP4活性的时机。众所周知，CK1ε的突变会导致果蝇和仓鼠的时钟振荡异常，并且很早就预测作为CK1ε作用点的底物蛋白在时钟功能中发挥着重要作用。因此，E4BP4是CK1ε下游的重要效应分子的发现不仅支持了E4BP4的生理重要性，而且在考虑治疗时钟疾病的药物靶点时也极其重要，可以说为我们提供了宝贵的知识。