Ｓｒｃファミリーキナーゼ活性を制御するラフト機構の解明：１分子観察法による研究

阐明控制Src家族激酶活性的筏机制：使用单分子观察方法的研究

• 批准号: 12J03930
• 负责人: 白居 祐希
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012 至 2013
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12J03930/
• 关键词: 脂質ラフト; Srcファミリーキナーゼ

SrcファミリーキナーゼLynの活性化/不活性化の切替が、タンパク質間、及び、ラフト脂質問相互作用の協同によってなされているという作業仮説の解明のため、Lynによってリン酸化され、同時にLyn不活性化のための足場タンパク質にもなる膜貫通型タンパク質Cbpに着目した。従来は、Cbpは常にEBP50-ERMを介してアクチン骨格と結合し、そこでほかのシグナル分子と相互作用するという静的なモデルが定説であったが、本研究によってCbpは常に拡散運動を行うことが明らかになった。このため、CbpとEBP50、ERM、アクチン骨格の結合、および、LynによるCbpリン酸化が、これらのタンパク質の結合に与える影響を検討した。まず、EBP50の細胞膜での挙動を観察した。イリノイ大学Wonhwa Cho教授よりGFP-EBP50を分与していただき、1分子観察を行った。EBP50の1分子観察の結果、EBP50が細胞質タンパク質としては、非常に珍しい挙動を示すことが明らかとなった。全反射蛍光顕微鏡では、細胞膜近傍約100nmにあるEBP50のみを観察することが出来るため、EBP50が細胞質から細胞膜にやってくる位置、すなわち、Cbpなどの膜タンパク質と相互作用する場所を知ることができる。ラット腎由来線維芽細胞にGFP-EBP50を発現させ、細胞膜にやってきた位置(点)を示すと、点の分布は、均一ではなく、ある領域では直線上に並んでいるところもあり、アクチン線維に結合していることが示唆される。さらに、点が密集した領域も存在することから、EBP50のhot spotが存在し、シグナル伝達プラットフォームが出来やすい場所がある可能性がある。

为了阐明以下假设：SRC家族激酶Lyn的激活/失活是通过蛋白质 - 蛋白质和RAFT-LIPID询问相互作用的合作来实现的，我们专注于跨膜蛋白CBP，该蛋白CBP是由Lyn磷酸化的，也是lyn磷酸化的，也是capfold蛋白质的lyn iNN iNNACTIVATION。以前，建立了一个静态模型，其中CBP始终通过EBP50-ERM与肌动蛋白骨骼结合并与那里的其他信号分子相互作用，但是这项研究表明CBP始终发生扩散运动。因此，我们研究了CBP与EBP50，ERM，肌动蛋白骨架和CBP磷酸化对这些蛋白质结合的影响。首先，观察到EBP50在细胞膜上的行为。伊利诺伊大学的Wonhwa Cho教授分发了GFP-EBP50，并观察到一个分子。对一个EBP50分子的观察结果表明，EBP50作为细胞质蛋白的行为非常异常。在总反射荧光显微镜中，只能观察到位于细胞膜附近约100 nm处的EBP50，从而使其能够知道EBP50从细胞质到细胞膜的eBP50在哪里，即它与膜蛋白相互作用的位置。当在大鼠肾脏衍生的成纤维细胞中表达GFP-EBP50并显示到达细胞膜的位置（点）时，这些点的分布并不均匀，在某些区域，它们在直线上排成一线，表明它们势必会肌动蛋白纤维。此外，有一些浓度点的区域，因此可能有一些热点EBP50，并且可能有一个可能形成信号平台的地方。