脊椎動物未受精卵の分裂停止因子Emi2の活性制御機構の解析

脊椎动物未受精卵有丝分裂阻滞因子Emi2活性调控机制分析

基本信息

批准号：
11J00139
负责人：
迫洸佑
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至 2013
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11J00139/
关键词：
細胞周期 Emi2 APC/C Ube2S Cdk1 PP2A

项目摘要

脊椎動物の未受精卵は第二減数分裂中期(Meta-II)で分裂を停止し、受精を待つ。Meta-II停止を引き起こす因子のエフェクターとして、APC/C (Anaphase promoting complex/cyclosome)抑制能をもつEmi2 (Early mitotic inhibitor 2)が知られている。Emi2は、自身のC末端に存在するRL tailを介してAPC/Cと結合する。本研究は、Emi2の活性化および安定化の分子メカニズムの解明も目的としており、Emi2が結合するAPC/Cサブユニットの特定が非常に重要であると考えられた。その結合の際に、Emi2がAPC/Cの活性化に必要な因子を排除するのではないかと仮定し、前年度の研究を進めた。その結果、RL tai1とアミノ酸配列が非常に酷似したC末端をもつUbe2S (E2ユビキチン結合酵素)がその候補として浮上した。そこで私は、Emi2がAPC/Cと結合する際に、APC/Cの同一サブユニット上でUbe2Sと競合することでMeta-II停止を引き起こしているのではないかと仮説を立て、本年度の研究を行った。まず、Meta-II停止時のツメガエル卵抽出液を用いて、APC/Cの免疫沈降を行った。すると、受精刺激後にEmi2が分解される際に、Ube2SとAPC/Cとの結合がMeta-II停止時に比べ4～5倍に上昇すること、その結合上昇にはEmi2の分解(APC/CからのEmi2の解離)が必須であることが分かった。次に、Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL)で発現させたAPC/Cサブユニットを用いた実験から、Emi2およびUbe2SはAPC/CのコアサブユニットであるAPC10と結合することが分かった。以上の結果から、Meta-II停止時において、Emi2はRL tailを介してAPC10と結合しUbe2Sと競合していることが強く示唆された。また、この結果は国際的にも高い評価を受け、平成26年3月17日付けでNature Communications誌に受理され、現在印刷中である。

未受精的脊椎动物卵在中期II（Meta-II）停止分裂并等待受精。 Emi2（早期有丝分裂抑制剂 2）能够抑制 APC/C（后期促进复合物/环体），被认为是导致 Meta-II 停滞的因子效应子。 Emi2 通过其 C 末端的 RL 尾部与 APC/C 结合。本研究还旨在阐明Emi2激活和稳定的分子机制，并且鉴定Emi2结合的APC/C亚基被认为极其重要。我们假设Emi2结合后会消除APC/C激活所需的因素，并在前一年继续了我们的研究。因此，C 端氨基酸序列与 RL tai1 非常相似的 Ube2S（E2 泛素结合酶）成为候选者。因此，我推测当Emi2与APC/C结合时，它可能会与APC/C的同一亚基上的Ube2S竞争，导致Meta-II终止，并且我进行了今年的研究。首先，停止 Meta-II 后，使用非洲爪蟾卵提取物对 APC/C 进行免疫沉淀。然后，当 Emi2 在受精刺激后降解时，与 Meta-II 停止解离时相比，Ube2S 和 APC/C 之间的结合增加了 4 至 5 倍。接下来，使用兔网织红细胞裂解物 (RRL) 中表达的 APC/C 亚基进行的实验表明，Emi2 和 Ube2S 与 APC10（APC/C 的核心亚基）结合。上述结果强烈表明，当 Meta-II 停止时，Emi2 通过 RL 尾部与 APC10 结合，并与 Ube2S 竞争。这一成果在国际上也获得了高度评价，并于2014年3月17日被Nature Communications接收，目前正在印刷中。