HP1によるAurora B複合体の動的構造解析とその空間制御機構の解明

利用HP1对Aurora B复合体进行动态结构分析并阐明其空间控制机制

基本信息

批准号：
22K15043
负责人：
迫洸佑
金额：
$ 3万
依托单位：
Japanese Foundation for Cancer Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2022
资助国家：
日本
起止时间：
2022-04-01 至 2025-03-31
项目状态：
未结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22K15043/
关键词：
染色体分配 Aurora B INCENP HP1 天然変性領域構造解析キネトコア CPC 液中構造解析

项目摘要

染色体分配時において、分裂期キナーゼのAurora Bを含む染色体パッセンジャー複合体(CPC)はセントロメアに局在し、動原体/微小管の結合異常の補正機能を担っていることが知られている。興味深いことに、Aurora Bは『局在範囲外』の動原体タンパク群を基質とするが、局在範囲外まで活性が届く分子背景は未だに不明である。我々は先行研究で、CPCの活性制御におけるHP1結合の必要性を見出していた。HP1はCPCの足場タンパク質であるINCENPの天然変性領域(IDR)中のPxVxL/I-motif (以下PVI)に結合するため、我々は「HP1結合時にIDR全長が状態変化し、CPCの活性到達範囲を広げる」という作業仮説を立てた。まず、Aurora B-INCENP組換えタンパク質を用いた先行実験および本年度の研究結果から、1) HP1の結合がINCENPの伸長反応を促進すること、2) その伸長反応にはINCENPのIDRが関与していること、の2つがHigh-Speed (HS) AFMによる液中構造解析から明らかとなった。加えて、細胞内においてこの伸長反応を強制的に阻害した際の表現型を解析するため、ラパマイシン介在型のFKBP/FRBヘテロダイマー形成を利用した屈曲誘導型のINCENP変異体を作製し、その変異体を恒常発現する細胞株の取得を行なった。この細胞に対し、ヘテロダイマー誘導剤を添加したところ、わずかにではあるがセントロメアのAurora B fociが凝縮しているように見えた。このことから、誘導剤を介したFKBP/FRBヘテロダイマー形成によって細胞内でINCENPの伸長反応阻害が起きた可能性が示唆された。

众所周知，在染色体分离过程中，含有有丝分裂激酶Aurora B的染色体过客复合物（CPC）定位于着丝粒，并在纠正异常着丝粒/微管耦合中发挥作用。有趣的是，Aurora B使用“定位范围之外”的动粒蛋白作为底物，但其活性到达定位范围之外的分子背景仍不清楚。在之前的研究中，我们发现了HP1结合在调节CPC活性中的必要性。 HP1 与 CPC 支架蛋白 INCENP 的自然变性区域 (IDR) 中的 PxVxL/I-motif（以下简称 PVI）结合。首先，从之前使用Aurora B-INCENP重组蛋白的实验和今年的研究结果来看，我们发现1）HP1的结合促进了INCENP的延伸反应，2）INCENP的IDR参与了延伸反应。使用高速 (HS) AFM 进行液内结构分析可以清楚地看出两件事。此外，为了分析细胞中强制抑制这种延伸反应时的表型，我们创建了弯曲诱导的INCENP突变体，该突变体利用雷帕霉素介导的FKBP/FRB异二聚体形成，并获得了组成型表达该蛋白的细胞系。当向这些细胞中添加异二聚体诱导剂时，着丝粒处的 Aurora B 焦点似乎被浓缩，尽管程度轻微。这表明诱导剂介导的 FKBP/FRB 异二聚体形成可能会抑制细胞中的 INCENP 延伸反应。